JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:25 min • July 8th, 2025
Białka wiążące RNA, RBP, działają jako regulatory potranskrypcyjne, wiążąc się z regionem inicjacji translacji, TIR, mRNA i hamując translację.
Aby zbadać interakcje RNA-RBP poprzez translacyjną represję genu reporterowego, weź hodowlę komórek bakteryjnych zawierającą dwa plazmidy - miejsce wiązania i plazmidy RBP.
Plazmid w miejscu wiązania koduje fluorescencyjny gen reporterowy. Po transkrypcji powstały TIR mRNA zawiera miejsce wiązania rybosomów i strukturę spinki do włosów, z sekwencją rozpoznawaną przez RBP.
Rybosomy wiążą się z miejscem wiązania na mRNA i destabilizują strukturę spinki do włosów, prowadząc do translacji mRNA i tworzenia fluorescencyjnych białek reporterowych. Plazmid RBP wyraża chimeryczny RBP połączony z innym białkiem fluorescencyjnym. Indukowalny promotor kontroluje chimeryczną ekspresję białka.
Dodaj induktor, który aktywuje czynnik transkrypcyjny, który wiąże się z promotorem, indukując ekspresję białka chimerycznego. RBP białka chimerycznego wiąże się ze strukturą spinki do włosów. Blokuje to wiązanie rybosomu z mRNA, hamując translację białka reporterowego.
Wraz ze wzrostem stężenia induktora zwiększa się produkcja RBP, co skutkuje silniejszym konkurencyjnym hamowaniem wiązania rybosomów z mRNA.
Zmierz różne sygnały fluorescencyjne z białek chimerycznych i reporterowych. Wykreślić sygnały, uzyskując krzywą dawka-odpowiedź.
Wraz ze wzrostem produkcji RBP za pośrednictwem induktora, represja translacyjna zmniejsza stężenie białka reporterowego, potwierdzając interakcję RNA-RBP.
Przekształć przygotowane plazmidy w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne zawierające już plazmid RBP-mCerulean. Aby zaoszczędzić czas, należy pokryć komórki za pomocą 8-kanałowego pipetora na 8-pasmowych płytkach zawierających agar Luria-Bertani z odpowiednimi antybiotykami. Kolonie powinny pojawić się w ciągu 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Wybierz pojedynczą kolonię dla każdego podwójnego transformantu i przenieś do 48-dołkowych płytek zawierających 1,5 mililitra LB z odpowiednimi antybiotykami. Hoduj komórki przez okres 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min. Przechowuj zapasy glicerolu na noc w temperaturze -80 stopni Celsjusza na 96-dołkowych płytkach.
Rano zaprogramuj robota tak, aby podgrzał 180 mikrolitrów półubogiego podłoża lub SPM w 96-dołkowych płytkach. Zaprogramuj robota tak, aby przygotował płytkę induktora.
Na czystej 96-dołkowej płytce przygotuj studzienki z SPM składającym się z 95% BA i 5% LB. Liczba studzienek odpowiada pożądanej liczbie stężeń induktora. Dodaj C4-HSL do studzienek w płytce induktora, które będą zawierały najwyższe stężenie induktora.
Następnie zaprogramuj robota tak, aby seryjnie rozcieńczał pożywkę z każdej z studni o najwyższym stężeniu do 23 niższych stężeń w zakresie od 0 do 218 nanomolowych. Objętość każdego rozcieńczenia induktora powinna być wystarczająca dla wszystkich szczepów.
Aby rozcieńczyć szczepy na noc, zaprogramuj robota tak, aby rozcieńczał się 10-krotnie, mieszając 20 mikrolitrów bakterii ze 180 mikrolitrami SPM w 48-dołkowych płytkach. Następnie ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, pobierając 20 mikrolitrów z rozcieńczonego roztworu na wstępnie przygotowaną płytkę naprężającą odpowiednią do pomiarów fluorescencyjnych.
Teraz zaprogramuj robota tak, aby dodał rozcieńczony induktor z płytki induktora do 96-dołkowych płytek z rozcieńczonymi szczepami zgodnie z końcowymi stężeniami. Potrząsaj 96-dołkowymi płytkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 6 godzin. W tym czasie co 30 minut wykonuj pomiary gęstości optycznej lub OD przy 595 nanometrach, a także fluorescencji mCherry i mCerulean za pomocą czytnika płytek.