JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:12 min • July 8th, 2025
Aby wykryć interakcje między heteromerycznymi kompleksami białkowymi obejmującymi wiele białek z docelowym DNA za pomocą zmodyfikowanego testu jednohybrydowego drożdży, należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą pożądane stężenie aktywnie rosnącej, przekształconej hodowli komórek drożdży.
Komórki te zawierają specyficzną sekwencję DNA przed genem kodującym β-galaktozydazę reporterową, napędzaną przez promotor GAL-4, przy jednoczesnym braku endogennego białka czynnika transkrypcyjnego GAL-4. Komórki wyrażają białko docelowe połączone z domeną aktywacji GAL-4 i innym białkiem pozbawionym domeny wiążącej DNA GAL-4.
Jeśli białka te wchodzą w interakcje, mogą tworzyć kompleks, umożliwiając białku docelowemu wiązanie się z sekwencją DNA w regionie promotorowym genu reporterowego. Domena aktywacji GAL-4 aktywuje ekspresję enzymu reporterowego β-galaktozydazy.
wirówka. Ponownie zawieś komórki w odpowiednim buforze. Zamroź i rozmroź komórki, aby je zlizować i uwolnić β-galaktozydazę. Dodać beta-merkaptoetanol i bufor zawierający substrat β-galaktozydazy.
Beta-merkaptoetanol stabilizuje enzym β-galaktozydazy. β-galaktozydaza hydrolizuje substrat β-galaktozydazy, tworząc żółty chromogen.
Dodaj roztwór węglanu sodu, aby zdenaturować β-galaktozydazę i zatrzymać reakcję. Wirówka. Przenieść supernatant zawierający żółty chromogen na płytkę wielodołkową. Za pomocą czytnika płytek zmierz gęstość optyczną roztworu na odpowiedniej długości fali, aby obliczyć aktywność β-galaktozydazy.
Wyższa aktywność β-galaktozydazy wskazuje na pozytywne interakcje między białkami a docelową sekwencją DNA, co prowadzi do ekspresji β-galaktozydazy.
Ponownie zawiesić hodowlę i przenieść 125 mikrolitrów z każdej studzienki na płytkę spektrofotometru. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach, aby upewnić się, że mieści się w zakresie od 0,3 do 0,6. Odwirować pozostałe komórki w bloku studzienki głębinowej w temperaturze 3000 g i 21 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć supernatant przez odwrócenie.
Dodaj 200 mikrolitrów buforu Z do każdej studzienki i wiruj. Wirować w temperaturze 3,000 g i 21 stopni Celsjusza przez 5 minut. Usunąć supernatant przez odwrócenie. Dodaj 20 mikrolitrów buforu Z do każdej studzienki i wiruj. Przykryj płytkę folią uszczelniającą, która jest odporna na cykle zamrażania i rozmrażania.
W dygestorii wykonaj cztery cykle zamrażania i rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu buforu Z/beta-merkaptoetanolu/ONPG do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 17 do 24 godzin lub do momentu powstania koloru. Sprawdź, czy kolor się rozwinął.
Dodaj 110 mikrolitrów 1 molowego węglanu sodu do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję. Zapisz czas i zawiruj płytkę. Wirować w temperaturze 3,000 g i 21 stopni Celsjusza przez 10 minut. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 125 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki na płytkę spektrofotometru. Zmierz gęstość optyczną przy 420 nanometrach.