Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:12 min. • July 8th, 2025
Aby wykryć interakcje między heteromerycznymi kompleksami białkowymi obejmującymi wiele białek z docelowym DNA za pomocą zmodyfikowanego testu jednohybrydowego drożdży, należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą pożądane stężenie aktywnie rosnącej, przekształconej hodowli komórek drożdży.
Komórki te zawierają specyficzną sekwencję DNA przed genem kodującym β-galaktozydazę reporterową, napędzaną przez promotor GAL-4, przy jednoczesnym braku endogennego białka czynnika transkrypcyjnego GAL-4. Komórki wyrażają białko docelowe połączone z domeną aktywacji GAL-4 i innym białkiem pozbawionym domeny wiążącej DNA GAL-4.
Jeśli białka te wchodzą w interakcje, mogą tworzyć kompleks, umożliwiając białku docelowemu wiązanie się z sekwencją DNA w regionie promotorowym genu reporterowego. Domena aktywacji GAL-4 aktywuje ekspresję enzymu reporterowego β-galaktozydazy.
wirówka. Ponownie zawieś komórki w odpowiednim buforze. Zamroź i rozmroź komórki, aby je zlizować i uwolnić β-galaktozydazę. Dodać beta-merkaptoetanol i bufor zawierający substrat β-galaktozydazy.
Beta-merkaptoetanol stabilizuje enzym β-galaktozydazy. β-galaktozydaza hydrolizuje substrat β-galaktozydazy, tworząc żółty chromogen.
D
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych