Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Białka o aktywności helikazy RNA mogą pomóc w odwinięciu i oddzieleniu pojedynczych cząsteczek RNA w dupleksie RNA.

Aby określić aktywność helikazy białka, weź probówki zawierające mieszaninę dupleksów RNA znakowanych biotyną z nawisem 5', ATP i pułapek RNA - nieznakowanych nici komplementarnych do biotynylowanych nici dupleksów.

Dodaj białko o aktywności helikazy do każdej probówki i inkubuj przez różny czas. Białko wiąże się z 5'-nawisem dupleksów.

Wykorzystując cząsteczki ATP, zrywa wiązania wodorowe między dwiema niciami dupleksowymi, co powoduje ich odwijanie i uwalnianie biotynylowanego jednoniciowego RNA. Pułapki RNA oddziałują z niciami znakowanymi biotyną, zapobiegając ponownemu wyżarzaniu oddzielonych nici.

Zakończ reakcję za pomocą bufora zakończenia.

Załadować próbki do różnych dołków natywnego żelu poliakrylamidowego. Uruchom elektroforezę. Jednoniciowe RNA o niskiej masie cząsteczkowej porusza się szybciej niż dupleksy o dużej masie cząsteczkowej. Ta zmiana mobilności generuje dwa odrębne pasma.

Osusz żel na nylonowej membranie, przenosząc RNA do membrany. Po osuszeniu wystaw membranę na działanie światła UV, sieciując RNA na membranie.

Dodaj chemiluminescencyjną stre