Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Białka o aktywności helikazy RNA mogą pomóc w odwinięciu i oddzieleniu pojedynczych cząsteczek RNA w dupleksie RNA.

Aby określić aktywność helikazy białka, weź probówki zawierające mieszaninę dupleksów RNA znakowanych biotyną z nawisem 5', ATP i pułapek RNA - nieznakowanych nici komplementarnych do biotynylowanych nici dupleksów.

Dodaj białko o aktywności helikazy do każdej probówki i inkubuj przez różny czas. Białko wiąże się z 5'-nawisem dupleksów.

Wykorzystując cząsteczki ATP, zrywa wiązania wodorowe między dwiema niciami dupleksowymi, co powoduje ich odwijanie i uwalnianie biotynylowanego jednoniciowego RNA. Pułapki RNA oddziałują z niciami znakowanymi biotyną, zapobiegając ponownemu wyżarzaniu oddzielonych nici.

Zakończ reakcję za pomocą bufora zakończenia.

Załadować próbki do różnych dołków natywnego żelu poliakrylamidowego. Uruchom elektroforezę. Jednoniciowe RNA o niskiej masie cząsteczkowej porusza się szybciej niż dupleksy o dużej masie cząsteczkowej. Ta zmiana mobilności generuje dwa odrębne pasma.

Osusz żel na nylonowej membranie, przenosząc RNA do membrany. Po osuszeniu wystaw membranę na działanie światła UV, sieciując RNA na membranie.

Dodaj chemiluminescencyjną streptawidynę sprzężoną z enzymem, która oddziałuje z biotyną na niciach dwupasmowych i jednoniciowych. Używaj podłoży chemiluminescencyjnych do wytwarzania produktów chemiluminescencyjnych.

Po zobrazowaniu intensywność pasma o niskiej masie cząsteczkowej wzrasta z czasem, korelując z aktywnością helikazy docelowego białka.

W przypadku testu aktywności helikazy MOV10 wymieszaj odczynniki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodaj wodę, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 mikrolitrów. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, 30 minut i 60 minut, a następnie dodaj 5X Stop Buffer, aby zatrzymać reakcję. Następnie przygotuj 20% natywny żel poliakryloamidowy i załaduj od 20 do 25 mikrolitrów każdej próbki do każdej studzienki. Uruchom żel pod napięciem 100 woltów w łaźni lodowej, aż niebieski marker bromofenolowy przeniesie się do dolnej ćwiartki żelu.

Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny. Ważne jest, aby obchodzić się z nim przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.

Zdemontuj płytki żelowe i przytnij żel, usuwając studzienki załadunkowe i nieużywane pasy ruchu. Umieść żel w buforze 0,5X TBE. Przytnij bibułę filtracyjną i membranę nylonową do rozmiaru żelu, wstępnie zwilż papier i membranę, a następnie zmontuj stos do przeniesienia.

Przenieść próbki z żelu na membranę w półsuchym aparacie elektroforetycznym o natężeniu 90 miliamperów przez 20 minut. Następnie należy usieciować próbki, napromieniając membranę z prędkością 120 milidżuli na centymetr kwadratowy przez 45 do 60 sekund.

W celu detekcji chemiluminescencyjnej zacznij od dodania 20 mililitrów buforu blokującego do membrany i inkubacji przez 15 do 30 minut, delikatnie wstrząsając. Ostrożnie usuń bufor blokujący i zastąp go sprzężonym buforem blokującym. Ponownie inkubować membranę przez 15 minut.

Umyj membranę cztery razy, potrząsając przez 5 minut na pranie. Następnie dodaj 30 mililitrów buforu równoważącego substrat do membrany i inkubuj go przez 5 minut, wstrząsając z prędkością od 20 do 25 obr./min.

Przykryj całą powierzchnię membrany roztworem roboczym substratu i inkubuj przez 5 minut. Po inkubacji skanuj membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez 1 do 3 sekund.