JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:42 min. • July 8th, 2025
Wywołane promieniowaniem pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) inicjują rekrutację białka naprawczego DNA w uszkodzonym miejscu - aktywując naprawę DNA.
Aby wykryć białka naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach DSB za pomocą immunofluorescencji pośredniej, należy pobrać szkiełka nakrywkowe zawierające komórki nabłonkowe. Naświetlić podzbiór komórek. Inkubować, pozwalając kontrolnym komórkom nienapromieniowanym i napromieniowanym rosnąć przez określony czas.
Potraktuj buforem, aby wyekstrahować jądra komórkowe. Napraw jądra komórkowe, aby zachować ich morfologię. Leczyć roztworem blokującym, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie przeciwciał pierwotnych.
Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko dwóm białkom naprawy DNA. Przeciwciała wiążą się z odpowiednimi białkami.
Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi oznaczonymi odpowiednio czerwonymi i zielonymi fluoroforami. Przeciwciała drugorzędowe – specyficzne dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego – wiążą się ze swoimi celami. Dodać podłoże montażowe zawierające DAPI na szkiełku podstawowym. Zamontuj na nim szkiełka nakrywkowe w celu obrazowania.
DAPI - barwnik wiążący DNA - wiąże się z bogatymi w AT mniejszymi rowka
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych