Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Wywołane promieniowaniem pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) inicjują rekrutację białka naprawczego DNA w uszkodzonym miejscu - aktywując naprawę DNA.

Aby wykryć białka naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach DSB za pomocą immunofluorescencji pośredniej, należy pobrać szkiełka nakrywkowe zawierające komórki nabłonkowe. Naświetlić podzbiór komórek. Inkubować, pozwalając kontrolnym komórkom nienapromieniowanym i napromieniowanym rosnąć przez określony czas.

Potraktuj buforem, aby wyekstrahować jądra komórkowe. Napraw jądra komórkowe, aby zachować ich morfologię. Leczyć roztworem blokującym, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie przeciwciał pierwotnych.

Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko dwóm białkom naprawy DNA. Przeciwciała wiążą się z odpowiednimi białkami.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi oznaczonymi odpowiednio czerwonymi i zielonymi fluoroforami. Przeciwciała drugorzędowe – specyficzne dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego – wiążą się ze swoimi celami. Dodać podłoże montażowe zawierające DAPI na szkiełku podstawowym. Zamontuj na nim szkiełka nakrywkowe w celu obrazowania.

DAPI - barwnik wiążący DNA - wiąże się z bogatymi w AT mniejszymi rowkami dwuniciowego DNA, przeciwbarwiąc jądra. Wizualizacja jąder komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

W porównaniu z nienapromieniowanymi jądrami komórkowymi, napromieniowane jądra wykazują wiele ognisk γH2AX, które zmniejszają się z czasem, co wskazuje na postępującą naprawę DNA w komórkach hodowanych przez dłuższy czas.

Nakładające się na siebie czerwone i zielone sygnały fluorescencji wydają się żółte, co wskazuje na kolokalizację γH2AX i 53BP1 w miejscu DSB po napromieniowaniu.

Zacznij od wyhodowania 40 000 komórek HeLa w każdym dołku 12-dołkowej płytki z 18-milimetrowym okrągłym szkiełkiem nakrywkowym do 80% konfluencji. Po wystawieniu komórek na działanie promieniowania gamma 4 Graya, umyj je dwukrotnie 1 mililitrem PBS. Następnie należy całkowicie usunąć PBS i dodać 200 mikrolitrów NEB do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć NEB.

Należy pamiętać, że czas inkubacji może się różnić w zależności od linii komórkowej, ale generalnie nie powinien przekraczać dwóch minut. Umyj komórki 1 mililitrem PBS. Następnie całkowicie usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów 4% PFA do każdej studzienki w celu utrwalenia komórek.

Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie usuń PFA i dodaj 1 mililitr PBS do każdej studzienki. Całkowicie usuń PBS, a następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj komórki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 16 do 18 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze rozcieńczania i wirować je, aż dobrze się wymiesza. W pojemniku na wilgoć przyklej kawałek parafilmu i dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego w jednej kropli. Wyrównaj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego ze studni z kroplą i powoli opuść ją na parafilm, rozprowadzając płyn. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji umyć szkiełka nakrywkowe trzy razy w PBS przez 1 minutę na pranie. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze rozcieńczającym i wirować, aż do dobrego wymieszania. Nałożyć 10 mikrolitrów przeciwciała wtórnego na każde szkiełko nakrywkowe, jak opisano wcześniej, i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS - i raz wodą - przez 1 minutę na pranie. Następnie zamontuj je na szkiełkach podstawowych za pomocą nośnika montażowego na bazie glicerolu zawierającego DAPI. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut. Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu 60X i użyj DAPI, aby zlokalizować jądra przez okular

W celu akwizycji obrazu XYZ otwórz oprogramowanie do akwizycji i ustaw "Typ skanera" na "Galvano", "Tryb skanera" na "Podróż w obie strony" i rozmiar obrazu "512 na 512". W panelu PMT ustaw tryb na VBM, średnią na Klatkę, a skanowanie sekwencyjne na Linia. Następnie ustaw detektory barwnika i ciepła. Ustaw kanał 1 na DAPI i SD1, kanał drugi na Alexa Fluor 488 i HSD3, a kanał 3 na Alexa Fluor 647 i HSD4. Wybierz "ON" w "Z".

Aby dostosować obraz na żywo, naciśnij przycisk Live w oknie Live i dostosuj ostrość. Następnie użyj okna "Narzędzie PMT", aby ustawić intensywność, czułość, wzmocnienie i przesunięcie lasera. W przypadku stosów Z wybierz opcję Od początku do końca i 15 wycinków. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy, i naciśnij przycisk LSM Start, aby rozpocząć pobieranie. Po zakończeniu naciśnij przycisk Seria Gotowe, aby zakończyć akwizycję obrazu.