Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Aby wyizolować białka wiążące RNA lub RBP - regulatory potranskrypcyjne - weź zawiesinę małych sond RNA zawierających element bogaty w adenylan-urydylan lub ARE - sekwencję rozpoznawaną przez docelowe RBP. Sondy RNA są znakowane destiobiotyną - pochodną biotyny.

Dodaj kulki magnetyczne pokryte streptawidyną – białkiem o powinowactwie do biotyny. Inkubować pod mieszaniem, aby zapobiec osiadaniu kulek. RNA znakowane destiobiotyną wiąże się ze streptawidyną, unieruchamiając w ten sposób RNA na kulkach.

Pod wpływem pola magnetycznego koraliki zbierają się z boku rurki. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić kulki w buforze zapewniającym optymalne pH do wiązania RBP-RNA.

Po wystawieniu na działanie magnesu koraliki zbierają się z boku tuby. Odrzucić supernatant. Zawiesić kulki w roztworze zawierającym docelowe RBP i inkubować pod wpływem mieszania.

Docelowe RBP posiadają motywy rozpoznawania RNA, które rozpoznają sekwencję ARE i wiążą się z RNA, tworząc w ten sposób kompleks RNA-białko unieruchomiony na kulkach.

Pod wpływem pola magnetycznego kulki poruszają się w kierunku magnesu, nie zakłócając oddziaływań białko-RNA. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić kulki w buforze elucyjnym za