Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Aby wyizolować białka wiążące RNA lub RBP - regulatory potranskrypcyjne - weź zawiesinę małych sond RNA zawierających element bogaty w adenylan-urydylan lub ARE - sekwencję rozpoznawaną przez docelowe RBP. Sondy RNA są znakowane destiobiotyną - pochodną biotyny.

Dodaj kulki magnetyczne pokryte streptawidyną – białkiem o powinowactwie do biotyny. Inkubować pod mieszaniem, aby zapobiec osiadaniu kulek. RNA znakowane destiobiotyną wiąże się ze streptawidyną, unieruchamiając w ten sposób RNA na kulkach.

Pod wpływem pola magnetycznego koraliki zbierają się z boku rurki. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić kulki w buforze zapewniającym optymalne pH do wiązania RBP-RNA.

Po wystawieniu na działanie magnesu koraliki zbierają się z boku tuby. Odrzucić supernatant. Zawiesić kulki w roztworze zawierającym docelowe RBP i inkubować pod wpływem mieszania.

Docelowe RBP posiadają motywy rozpoznawania RNA, które rozpoznają sekwencję ARE i wiążą się z RNA, tworząc w ten sposób kompleks RNA-białko unieruchomiony na kulkach.

Pod wpływem pola magnetycznego kulki poruszają się w kierunku magnesu, nie zakłócając oddziaływań białko-RNA. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić kulki w buforze elucyjnym zawierającym biotynę.

Biotyna wypiera destiobiotynę z kulek poprzez konkurencyjne wiązanie się ze streptawidyną, uwalniając w ten sposób kompleks białko-RNA.

Oceń obecność docelowych RBP w eluacie, aby potwierdzić interakcje białko-RNA.

Umyj wstępnie 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny na 50 pikomoli RNA. Wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi streptawidyny przez 15 sekund. Po szybkim wirowaniu wyjmij 200 mikrolitrów do czystej 1,5-mililitrowej bezpiecznej rurki z blokadą za pomocą przeciętych końcówek pipet. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym, tak aby koraliki zebrały się z boku rurki i odczekaj minutę. Usunąć płyn do sporządzania zawiesiny.

Aby umyć kulki, wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego o pojemności 400 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu, 0,05 molowego roztworu chlorku sodu i delikatnie kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym i odczekaj minutę, a następnie zbierz supernatant.

Umyj kulki 200 mikrolitrami 100-milimolowego chlorku sodu i usuń supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów 20 milimolowych Tris. Ponownie zawiesić kulki przez pipetowanie i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym. Po jednej minucie usunąć supernatant. Następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego o pojemności 200 mikrolitrów bufora do wychwytywania 1x RNA i ponownie zawieś kulki magnetyczne streptawidyny przez krótkie wirowanie.

Usuń 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny i dodaj je do każdej oznaczonej probówki RNA za pomocą przeciętej końcówki pipety. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wałku. Po umieszczeniu probówki na stojaku magnetycznym przez jedną minutę, usunąć supernatant. Dodaj 50 mikrolitrów 20-milimolowego Tris do kulek i ponownie je zamieszaj. Następnie umieść rurki w stojaku magnetycznym. Po jednej minucie usunąć supernatant.

Dodaj 100 mikrolitrów 1x bufor wiążący białko-RNA do kulek i ponownie je zawieś. Następnie umieść rurki z powrotem w stojaku magnetycznym. Gdy probówki znajdują się w stojaku przez 1 minutę, zebrać supernatant. Dodać 100 mikrolitrów mieszanki wzorcowej B. Zawiesić, delikatnie pipetując w górę iw dół, unikając tworzenia pęcherzyków. Inkubować probówki reakcyjne przez 60 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza na walcu.

Przejdź do etapów płukania i elucji. Umieść probówki w stojaku magnetycznym. Zebrać przepływ i przenieść go do nowej probówki. Odpipetuj 100 mikrolitrów 1X buforu do płukania na kulkach. Delikatnie zawieś ponownie. Umieść je z powrotem w stojaku. Odczekać minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy.

Dodaj 40 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek magnetycznych. Mieszać pipetując w górę i w dół i inkubować na wytrząsarce probówkowej. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj minutę i zbierz próbkę eluatu. Umieścić na lodzie i użyć do dalszej analizy.