JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:43 min • July 8th, 2025
Aby zbadać interakcję białek z cząsteczkami lipidów, zacznij od dwóch rurek kapilarnych. Dodaj białka testowe znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w obu probówkach i nieznakowane cząsteczki lipidów do jednej z nich. Umieść te naczynia włosowate w tablicy i umieść je w przyrządzie do termoforezy w mikroskali.
Naświetlić kapilar zawierającą białko skupionym światłem podczerwonym, powodując wzrost temperatury w ognisku, który dyfunduje przez roztwór, generując gradient temperatury w wąskim obszarze zawierającym białka znakowane fluorescencyjnie.
Detektor fluorescencji zbiera sygnał fluorescencyjny z tego samego miejsca kapilary - w którym skupia się laser. Procesor przetwarza sygnał i generuje wykres względnej fluorescencji w funkcji czasu.
W gradiencie temperatury znakowane białka zaczynają migrować z cieplejszego obszaru do chłodniejszego, wykazując termoforezę – zjawisko migracji zależnej od temperatury.
Dzięki termoforezie intensywność fluorescencji stopniowo zmniejsza się w czasie i osiąga stan ustalony, w którym znakowane białka osiągają równowagę.
Napromieniować naczynia włosowate zawierające mieszankę białkowo-lipidową, tworząc gradient temperatury.
Podczas termoforezy migrujące znakowane białka oddziałują z cząsteczkami lipidów, tworząc kompleksy lipidowo-białkowe o większych masach cząsteczkowych. Prowadzi to do opóźnienia ich ruchu.
Ta zróżnicowana migracja powoduje zmianę fluorescencji, potwierdzając udaną interakcję białko-lipid
.Przed rozpoczęciem analizy włącz wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia MST i otwórz oprogramowanie sterujące. Upewnij się, że komputer jest podłączony do urządzenia i ma status "Połączono", a następnie ustaw MST Przed na 3 sekundy, MST na 30 sekund, a Odzyskiwanie fluorescencji na po 1 sekundzie.
Dla każdej rurki kapilarnej wprowadź nazwę liganda docelowego, nazwę analitu liganda, stężenie celu i najwyższe stężenie miareczkowania przy użyciu współczynnika miareczkowania z autouzupełnianiem. Wybierz zakres mocy MST i wprowadź wartości dla każdej mocy, aby przetestować najsolidniejsze dopasowanie wiązania.
Aby przygotować znakowane próbki MST, należy rozcieńczyć roztwór Vam7-oktahistydyny do stężenia 200 nanomolowych i barwnika NTA-Atto 647 do stężenia 100 nanomolowych, oba w PBS. Wymieszać Vam7-oktahistydynę i barwnik NTA-Atto 647 w stosunku objętościowym 1 do 1 i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej, chronioną przed światłem, na 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować mieszaninę barwnika i białka i przechowywać roztwór w temperaturze 4 stopni Celsjusza do kilku godzin przed użyciem. Następnie przygotuj próbkę. Weź barwnik do liganda i odsłoń analit.
W celu termoforezy próbki w mikroskali otwórz urządzenie i wysuń stojak kapilarny. Załaduj kapilary na próbki do stojaka o najwyższym stężeniu w pozycji 1 i wybierz czerwony kanał w oprogramowaniu sterującym. Następnie załaduj stojak do instrumentu. Następnie wybierz zakres mocy MST i rozpocznij pomiar Cap Scan + MST i oceń reakcję na zmianę.