Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu lub PIP2 jest niewielkim fosfolipidem związanym z błoną. Fosfolipaza C lub PLC, ze specyficznymi domenami wiążącymi PIP2, wiąże się z PIP2, generując wtórne przekaźniki niezbędne dla kilku procesów komórkowych.

Aby wykryć interakcje PLC-PIP2 in vitro, należy rozpocząć od małego pęcherzyka jednowarstwowego, SUV, kwaśnej zawiesiny, składającej się z mieszaniny PIP2 i fosfolipidów, z których jeden jest sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym wrażliwym na pH.

Odpipetować roztwór do wstępnie zmontowanego, spreparowanego urządzenia mikroprzepływowego na wlocie i podłączyć rurkę wylotową. Przenieś i zabezpiecz urządzenie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Poprzez grawitację SUV-y przechodzą przez dno mikrokanału, wykonane z hydrofilowego szkła nakrywkowego.

SUV-y adsorbują się na powierzchni szkła, a pH roztworu zmniejsza odpychanie elektrostatyczne między nimi. SUV-y oddziałują z powierzchnią, odkształcając się i stapiając, tworząc duże pęcherzyki.

Po krytycznym pokryciu powierzchni pęcherzyki pękają spontanicznie, tworząc podpartą dwuwarstwę lipidową, SLB. Przepuść bufor przez kanał, usuwając niezaabsorbowane pęcherzyki.

Korzystając z odpowiedniego kanału fluorescencyjnego, zobrazuj mikrokanał, aby uwidocznić i zmierzyć fluorescencję barwnika wrażliwą na pH - wysoce fluorescencyjną przy niskim pH - w SLB.

Wprowadź rekombinowane rozwiązanie PLC do mikrokanału. Neutralne pH roztworu, poniżej punktu izoelektrycznego sterownika PLC, sprawia, że sterownik PLC jest naładowany dodatnio.

Rekombinowany sterownik PLC, ze swoją domeną wiążącą PIP2, wiąże się z PIP2, rekrutując ujemnie naładowane jony wodorotlenkowe do powierzchni dwuwarstwy. To sprawia, że powierzchnia dwuwarstwowa jest bardziej podstawowa, zmieniając stan protonacji barwnika i powodując wygaszanie fluorescencji, co wskazuje na interakcje PLC-PIP2.

Przenieść 100 mikrolitrów 5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu-4 zawierającego małe pęcherzyki jednowarstwowe do 0,65-mililitrowej probówki wirówkowej. Dostosuj pH roztworu do około 3,2, dodając 6,4 mikrolitra 0,2 normalnego kwasu solnego.

Odpipetować 10 mikrolitrów małego roztworu pęcherzyków jednowarstwowych o dostosowanym pH do każdego kanału przez wlot i wywierać ciśnienie przez pipetę, aż roztwór dotrze do wylotu. Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia. Po powtórzeniu tego kroku dla każdego kanału, inkubuj urządzenie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Iniekcja pęcherzyków do mikrokanalików powinna być wykonana bezpośrednio po montażu urządzenia. W międzyczasie przetnij zestawy rurek doprowadzających i wylotowych. Za pomocą pęsety podłącz zestaw wężyków wylotowych do urządzenia, a następnie przyklej urządzenie do stolika mikroskopu.

Zanurz jeden koniec zestawu rurki wlotowej w 25 mililitrach bufora roboczego zawartego w stożkowej rurce i przyklej taśmą, aby upewnić się, że rurka jest zabezpieczona. Za pomocą podnośnika laboratoryjnego umieść stożkową rurkę na wyższym podłożu niż urządzenie, aby przepchnąć roztwór przez mikrokanały za pomocą przepływu grawitacyjnego.

Dla każdej rurki wlotowej użyj strzykawki, aby pobrać 1 mililitr buforu roboczego z wolnego końca rurki. Wyjmij końcówkę pipety z wlotu i włóż wolny koniec rurki wlotowej do urządzenia. Powtórz ten proces, aby podłączyć wszystkie elementy rurki dopływowej do urządzenia. Przepływający bufor przepływający przez kanały pomaga usunąć nadmiar niepękniętych pęcherzyków i zrównoważyć dwuwarstwę do warunków eksperymentalnych.

Następnie otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem. Na lewym panelu kliknij zakładkę "Mikroskop" i wybierz obiektyw "10x". Kliknij "Na żywo", a następnie ikony obrazu "Alexa 568" na pasku narzędzi. Za pomocą pokręteł regulacji Fine i Coarse skup się na mikrokanałach. Przeskanuj urządzenie, aby sprawdzić jakość SLB i kanałów.

Następnie kliknij ikonę obrazu "FL Shutter Closed" na pasku narzędzi. Kliknij zakładkę "Akwizycja" i w sekcji "Podstawowe korekty" wybierz czas ekspozycji. Ustaw czas ekspozycji na 200 milisekund. W lewym panelu kliknij "Akwizycja wielowymiarowa". W menu "Filtry" wybierz czerwony kanał. Następnie kliknij menu "Poklatkowy". Ustaw przedział czasu na 5 minut, czas trwania na 30 minut i menu poklatkowe.

Wybierz narzędzie "Okrąg" w zakładce "Zmierz" i narysuj okrąg w dowolnym kanale. Kliknij prawym przyciskiem myszy, gdy okrąg jest zaznaczony i wybierz "Właściwości". W zakładce "Profil" zaznacz "wszystkie T", aby wyświetlić intensywność fluorescencji w funkcji czasu. Upewnij się, że ta krzywa osiąga plateau, co wskazuje równowagę, zanim przejdziesz do następnego kroku.

Opuścić roztwór buforowy do równego podłoża co urządzenie, aby zatrzymać przepływ. Pojedynczo odłącz każdą rurkę wylotową i nałóż 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia białka do kanału wylotowego za pomocą pipety. Nie wywieraj żadnego nacisku. Niech grawitacja zrobi robotę. Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia mikroprzepływowego. Powtórz ten proces dla każdego kanału i upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie zostaną wprowadzone do kanałów podczas tego procesu.

Następnie opuść rurkę wlotową na ziemię poniżej urządzenia mikroprzepływowego, aby rozpocząć przepływ białka przez mikrokanały. Przyklej wolny koniec rurki do pojemnika na odpady. Przepływaj rozcieńczenia domeny homologii Pleckstrina przez 30 minut. W lewym panelu oprogramowania, w zakładce "Time-Lapse", kliknij "Start", aby ponownie rozpocząć obrazowanie.