Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła dla oligomerów białkowych

Oligomer białkowy to kompleks wielu podjednostek białkowych, które są ze sobą połączone, tworząc większą jednostkę funkcjonalną.

Aby określić masę cząsteczkową monomerów białkowych i ich oligomerów w roztworze za pomocą SEC-MALS, kombinacji chromatografii wykluczania wielkości i wielokątowego rozpraszania światła, należy rozpocząć od chromatografii wykluczania wielkości lub kolumny SEC.

Kolumna zawiera porowate, przypominające sito, kuliste kulki żelowe, które zatrzymują w sobie cząsteczki o mniejszych rozmiarach. Zrównoważyć kolumnę buforem zgodnym ze stanem natywnym białka.

Umieścić próbkę zawierającą monomery i oligomery białkowe na górze kolumny.

Podczas przepływu oligomery przechodzą przez przestrzeń międzycząsteczkową kolumny, podczas gdy monomery zostają uwięzione w porach kulek. Powoduje to, że oligomery białkowe o większych rozmiarach przemieszczają się szybciej niż monomery o mniejszych rozmiarach.

Szybko eluujące się oligomery, a następnie wolno uwalniające się monomery, należy skierować do detektora MALS.

Gdy przechodzą przez detektor, oświetla je światło laserowe, które jest rozpraszane pod różnymi kątami. Oligomery wielopodjednostkowe rozpraszają więcej światła niż monomer.

Intensywność światła rozproszonego pod wieloma kątami jest wprost proporcjonalna do masy cząsteczkowej oligomeru i monomeru białka.

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania systemu SEC-MALS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Używając odczynników klasy HPLC, przygotuj jeden litr soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 50 do 100 mililitrami chlorku sodu. Przefiltruj bufor do 0,1 mikrona za pomocą butelkowego filtra polieterowo-sulfonowego lub podobnego.

Przefiltruj pierwsze 50 do 100 mililitrów buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów. Następnie przefiltruj pozostałą część do czystej, sterylnej butelki, która została wcześniej umyta przefiltrowaną, dejonizowaną wodą i przechowywana, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.

Przepłukać kolumnę przez noc z natężeniem przepływu 0,5 mililitra na minutę, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu "Ciągły przepływ" FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone. Umieść celę przepływową dRI w trybie przedmuchiwania podczas płukania przez noc.

Rozpoczynając spłukiwanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi "zrzucania kolumny" spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.

Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki. Obserwuj sygnał w detektorze 90 stopni na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy hałas międzyszczytowy nie przekracza 50 do 100 mikrowoltów. Sprawdź również, czy współczynnik załamania światła lub sygnał RI jest stabilny do mniej niż 1 x ^10-7 jednostek indeksu załamania światła.

Wykonać "ślepą" próbę wstrzyknięcia, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. "Ślepa próba" to po prostu bufor do biegania przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce. Jeśli pik cząstek nie przekracza 1 mililitra objętości i nie więcej niż 5 miliwoltów powyżej linii podstawowej, system jest gotowy na próbki. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia do czasu oczyszczenia lub wykonaj konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza.

Teraz przygotuj co najmniej 200 mikrolitrów BSA w stężeniu od 1 do 2 miligramów na mililitr w buforze SEC. Przefiltruj białko do 0,025 mikrona za pomocą filtra z końcówką strzykawki. Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów. Alternatywnie, odwirować próbkę z prędkością 10 000 razy g przez 15 minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek. Następnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu BSA do pętli.