Konkurencyjny test wiązania w celu identyfikacji związków zakłócających interakcje receptor-ligand

Test wiązania konkurencyjnego identyfikuje małe cząsteczki, które zakłócają interakcje receptor-ligand poprzez konkurencyjne wiązanie z receptorem docelowym, hamując naturalne wiązanie ligandów.

Aby zidentyfikować interakcje receptora z jego naturalnym ligandem w obecności specyficznego dla receptora antagonisty małych cząsteczek, należy rozpocząć od zawieszenia ludzkich komórek limfocytów T wyrażających receptor docelowy.

Dodać zawiesinę komórkową do studzienek płytki wielodołkowej zawierającej rosnące stężenia antagonistów. Inkubować. Antagonista wiąże się z ortosterycznym miejscem wiązania - naturalnym miejscem wiązania ligandu receptora.

Dodaj do studzienek stałe stężenie znakowanych fluorescencyjnie naturalnych ligandów. Inkubować.

Przy niskich stężeniach antagoniści zajmują niewiele ortosterycznych miejsc wiązania, umożliwiając naturalne wiązanie ligandów z receptorami. Jednak przy wyższych stężeniach antagoniści zajmują większość ortosterycznych miejsc wiązania, umożliwiając minimalne naturalne wiązanie ligand-receptor

Odwirować do granulowania komórek. Odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w paraformaldehydzie, aby je utrwalić, zachowując morfologię komórkową.

Za pomocą cytometru przepływowego przeanalizuj sygnały fluorescencyjne z poszczególnych limfocytów T wyrażających receptory związane z antagonistą i fluorescencyjnym ligandem.

Zależne od dawki zmniejszenie średniej intensywności fluorescencji wraz ze wzrostem stężeń antagonistów specyficznych dla receptorów wskazuje na konkurencyjne wiązanie antagonistów z ortosterycznymi miejscami wiązania receptorów, hamując naturalną interakcję ligand-receptor

Na początek dozuj 100 mikrolitrów roztworu złożonego do przezroczystej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem zgodnie z wcześniej zdefiniowanym układem eksperymentalnym.

Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej ze zbiornika odczynnika do 96-dołkowej płytki za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubuj płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów znakowanego fluorescencyjnie 100 nanogramów na mililitr CXCL12 z podobnego zbiornika odczynnika do dołków 96-dołkowej płytki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Następnie odwiruj 96-dołkową płytkę przy 400-krotności grawitacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant z granulowanych komórek, odwracając płytkę. Osusz płytkę na chusteczce. Dodać 200 mikrolitrów świeżego buforu do testu ze zbiornika odczynnika do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.

Natychmiast przystąp do ponownego odwirowania płytki przez 5 minut przy 400-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej. Ponownie usuń supernatant, odwracając płytkę, a następnie susząc ją na chusteczce. Na koniec delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach 1% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS. Ten krok naprawi komórki.

Aby przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, uruchom urządzenie i otwórz odpowiednie oprogramowanie. Wybierz parametry sieci komórkowej, które mają być wizualizowane w formacie kropkowym, jako obszar rozproszenia do przodu, obszar rozproszenia bocznego i, w widoku histogramu, kanał wykrywania fluoroforu.

Należy wybrać jedną próbkę, na przykład próbkę kontroli ujemnej, w celu przeprowadzenia bramkowania zdefiniowanej jednorodnej populacji komórek w oparciu o parametry rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego. Dostosuj ustawienia ładowania komórek do urządzenia do cytometrii przepływowej.

Przed wstrzyknięciem należy wybrać trzy mieszanki. Wybierz automatyczne wstrzykiwanie 100 mikrolitrów utrwalonych komórek i użyj natężenia przepływu próbki 1,5 mikrolitra na sekundę. Uruchom przykład, wybierając pozycję "Pobierz dane". Parametry rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego dla tej próbki, a także detekcji fluoroforu pojawią się teraz na ekranie.

Teraz wybierz narzędzie do bramkowania oprogramowania. Na podstawie wizualizacji wykresu punktowego rozproszenia do przodu i z bocznym rozproszeniem wstępnie zdefiniuj jednorodną i żywotną populację komórek przez bramkowanie. Wybierz tę opcję, aby przeanalizować 20 000 "zdarzeń" na próbkę.

Oznacza to, że dla każdej próbki ostatecznie zostanie przeanalizowanych 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce. Zbieranie danych będzie kontynuowane do momentu osiągnięcia tej liczby zdarzeń.

Rozpocznij przebieg, wybierając najpierw studnie, które mają zostać przeanalizowane. Następnie wybierz "Uruchom studnie".

Urządzenie do cytometrii przepływowej będzie teraz analizować te próbki jedna po drugiej, rejestrując średnią intensywność fluorescencji dla każdej próbki, która odpowiada średniemu sygnałowi fluorescencyjnemu z 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce.

Na koniec przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole.