Test reporterowy oparty na teście ELISA do badania interakcji receptor-ligand w komórkach BW

Aby zbadać interakcje receptor-ligand, należy rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej pożywkę z komórkami docelowymi eksprymującymi ligandy testowe na swojej powierzchni.

Dodaj zmodyfikowane mysie komórki BW - nową populację komórek B wyrażających receptory chimeryczne związane z błoną. Receptory chimeryczne obejmują specyficzną domenę zewnątrzkomórkową receptora połączoną z transbłonową i wewnątrzkomórkową domeną sygnalizacyjną receptora komórek B.

Ligandy na komórkach docelowych oddziałują z zewnątrzkomórkową domeną chimerycznych receptorów komórek BW, powodując wewnątrzkomórkową aktywację domeny sygnalizacyjnej w komórkach BW. To wyzwala dalszą sygnalizację i produkcję cytokin - wydzielniczych cząsteczek reporterowych, które są uwalniane na zewnątrz komórek BW, pojawiając się w pożywce.

Odwirować płytkę. Przenieść supernatant zawierający cytokiny na płytkę ELISA wstępnie pokrytą przeciwciałami antycytokinowymi. Cytokiny oddziałują z regionami Fab przeciwciał, prowadząc do ich unieruchomienia na powierzchni płytki.

Potraktuj płytkę roztworem blokującym, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Dodaj biotynylowane przeciwciała antycytokinowe, które oddziałują z wstępnie związanymi cytokinami i tworzą kompleksy immunologiczne.

Na płytkę nałożyć sprzężony z enzymem roztwór streptawidyny. Streptawidyna wiąże się z biotyną na kompleksach immunologicznych.

Potraktuj płytkę podłożem. Interakcja enzym-substrat wytwarza kolorowy produkt, nadając roztworowi ten sam kolor. Kolorowy roztwór potwierdza obecność cząsteczek reporterowych, co wskazuje na udaną interakcję receptor-ligand.

Użyj 50 000 transfekowanych komórek BW z pożądanymi celami w jednym dołku 96-dołkowej płytki. Inkubować płytkę przez 48 godzin. Następnie zamroź płytkę w temperaturze -20 stopni Celsjusza.

Pokryj płytkę ELISA przeciwciałem anty-mysim IL-2. Umieścić 0,05% mikrogramów anty-mysiej IL-2 w objętości 50 mikrolitrów PBS w każdym dołku. Inkubować powlekaną płytkę przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Użyj krótkiego okresu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozmrozić zamrożone komórki BW, które były wcześniej inkubowane ze swoimi celami. Następnie odwirować płytkę i przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki do wstępnie pokrytej płytki ELISA i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny.

Następnie dodaj biotynę anty-mysie-IL-2 do płytki ELISA. Następnie, po inkubacji i umyciu, dodać do płytki streptawidynę sprzężoną z HRP. Po inkubacji i umyciu dodać 100 mikrolitrów roztworu substratu TMB do każdego dołka płytki ELISA. Na koniec odczytaj płytkę ELISA przy 650 nanometrach.