Sonda wymuszająca biomembranę do ilościowego określania interakcji receptor-ligand

Interakcja między receptorem limfocytów T, TCR, a peptydem antygenowym prezentowanym przez MHC lub główny kompleks zgodności tkankowej na komórce prezentującej antygen, APC, powoduje, że komórka T wywiera siłę mechaniczną na APC. Zjawisko to jest niezbędne do aktywacji limfocytów T.

Aby określić ilościowo interakcje receptor-ligand za pomocą sondy siły biomembrany, BFP, zacznij od niestandardowej komory komórkowej opartej na szkiełku. Umieść komorę komórkową pod mikroskopem.

Wstrzyknąć do komory zawiesiny biotynylowanych, spuchniętych erytrocytów, szklane kulki sondy pokryte związanymi z peptydami kompleksami MHC-streptawidyna-biotyna i limfocyty T. Umieść mikropipety wypełnione buforem buforowym sondy, tarczy i pomocnika wokół komory.

Odessać biotynylowane erytrocyty za pomocą pipety z sondą, umieszczając ją w pustym miejscu. Zassać komórkę T za pomocą docelowej mikropipety, umieszczając ją po prawej stronie RBC. Odessać kulkę sondy za pomocą mikropipety pomocniczej i przymocować ją do wierzchołka RBC. Streptawidyna zawarta w kulce wiąże się z biotyną RBC i tworzy sondę siły.

Dopasuj limfocyt T do sondy siły, aby umożliwić TCR interakcję ze swoim ligandem - peptydem związanym z MHC - a komórką T w celu wywierania siły na RBC. Cofnij komórkę T, aby zerwać wiązanie peptydowe TCR, które deformuje RBC i przemieszcza koralik.

Zmierz siłę potrzebną do zerwania wiązania ― silniejsze wiązanie wymaga większej siły i więcej czasu na zerwanie, co wskazuje na dłuższą żywotność.

Aby rozpocząć eksperyment BFP, włącz mikroskop i źródło światła. Umieść komorę na głównym stoliku mikroskopu. Następnym krokiem jest zainstalowanie wszystkich trzech mikropipet BFP. Sonda po lewej stronie służy do chwycenia RBC. Celem po prawej stronie jest złapanie komórki, a pomocnik po prawej stronie dolnej służy do złapania koralika.

Aby zainstalować, użyj mikrowtryskiwacza, aby wypełnić mikropipetę eksperymentalnym buforem. Zdejmij mikropipetę z uchwytu na pipety i przytrzymaj ją w niższym miejscu, aby płyn mógł kapać z końcówki. Szybko włóż mikropipetę do końcówki uchwytu, upewniając się, że podczas wkładania mikropipety nie dostanie się do niej mikropęcherzyki powietrza.

Dokręć uchwytu, a następnie zamontuj każdy uchwyt pipety na odpowiednim mikromanipulatorze. Popchnij mikropipetę w kierunku komory tak, aby jej końcówki weszły w obszar buforowy komory. Wyreguluj położenie mikropipety i znajdź ją w polu widzenia mikroskopu.

Poruszaj się po scenie posiadacza komnaty, aby znaleźć kolonie trzech żywiołów jeden po drugim. Wyreguluj położenie odpowiedniej mikropipety, obracając pokrętła manipulatorów tak, aby końcówka mikropipety zbliżyła się do jednej komórki lub kulki. Zassać komórkę lub kulkę, regulując ciśnienie wewnątrz odpowiedniej mikropipety. Wszystkie trzy mikropipety będą rejestrować odpowiadające im elementy.

Poruszaj się po stoliku z uchwytem komory, aby znaleźć otwartą przestrzeń z dala od kolonii wstrzykniętych elementów, w których zostanie przeprowadzony eksperyment.

Przełącz tryb wizualny mikroskopu, aby zobrazować obraz w programie komputerowym. Przesuń wszystkie trzy elementy na końcówkach pipet w pole widzenia programu. Następnie wyrównaj koralik sondy i RBC i ostrożnie manewruj koralikiem sondy do wierzchołka RBC. Teraz krótko uderz koralik w RBC i delikatnie wycofaj.

Wyreguluj ciśnienie mikropipety pomocniczej, aby delikatnie zdmuchnąć kulkę, tak aby pozostała przyklejona do wierzchołka RBC. Odsuń mikropipetę pomocniczą i wyrównaj tarczę oraz koralik sondy.

W programie, w oknie Pole widzenia, użyj narzędzi programu, aby zmierzyć odpowiednie promienie mikropipety sondy, RBC i okrągłą powierzchnię styku między RBC a koralikiem sondy. Wartości te pozwalają na oszacowanie stałej sprężystości RBC za pomocą równania podanego w protokole tekstowym.

Po wprowadzeniu do programu żądanej stałej sprężystości RBC, narysuj poziomą linię w poprzek wierzchołka RBC, która da krzywą w sąsiednim oknie wskazującą jasność każdego piksela wzdłuż tej linii. Przeciągnij linię progu tak, aby znajdowała się mniej więcej na połowie głębokości krzywej.

Następnie wybierz żądany tryb eksperymentu. Ustaw parametry zgodnie z potrzebami. Kliknij przycisk Start, co umożliwia programowi przesunięcie pipety docelowej i wprowadzenie i odłączenie celu od kontaktu z sondą.

Zbieranie danych będzie odbywać się równolegle, co rejestruje pozycję koralika sondy w czasie rzeczywistym. Zatrzymaj program, klikając przycisk Zatrzymaj eksperyment, w którym to czasie wyskoczy okno umożliwiające zapisanie pozyskanych danych.