JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:05 min. • July 8th, 2025
Białka wiążące nukleotydy guaniny – kategoria GTPaz – działają jako przełącznik molekularny, cyklicznie przełączając się między aktywną formą związaną z GTP a nieaktywną formą związaną z GDP.
Aktywne GTPazy wiążą się ze specyficznymi partnerami białkowymi. Partnerzy ci konkurują o tę samą wiążącą witrynę w GTPaza.
Aby zbadać wiązanie konkurencyjne, zacznij od pobrania zawiesiny GTPazy związanej z GTP unieruchomionej na kulkach magnetycznych. Dodaj pierwszego partnera interakcji - fluorescencyjnie znakowane białko A. Inkubuj pod mieszaniem, aby utrzymać kulki w zawiesinie. Białko A wiąże i nasyca miejsca wiązania na wszystkich cząsteczkach GTPazy.
Podziel to rozwiązanie równo na wiele rur. Dodaj drugiego partnera interakcji - fluorescencyjnie znakowane białko B - do probówek w coraz większych ilościach. Inkubować pod wpływem mieszania.
Białko B wiąże się z tym samym miejscem wiązania w GTPazach — kompetycyjnie wypierając białko A.
Wystaw rurki na działanie pola magnetycznego, aby zebrać koraliki z jednej strony. Odrzucić sklarowany nad osadem w celu usunięcia niezwiązanych białek. Ponownie zawiesić kulki skompleksowane białkami w odpowiednim buforze i określić ilościowo związane bia
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych