JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:05 min • July 8th, 2025
Białka wiążące nukleotydy guaniny – kategoria GTPaz – działają jako przełącznik molekularny, cyklicznie przełączając się między aktywną formą związaną z GTP a nieaktywną formą związaną z GDP.
Aktywne GTPazy wiążą się ze specyficznymi partnerami białkowymi. Partnerzy ci konkurują o tę samą wiążącą witrynę w GTPaza.
Aby zbadać wiązanie konkurencyjne, zacznij od pobrania zawiesiny GTPazy związanej z GTP unieruchomionej na kulkach magnetycznych. Dodaj pierwszego partnera interakcji - fluorescencyjnie znakowane białko A. Inkubuj pod mieszaniem, aby utrzymać kulki w zawiesinie. Białko A wiąże i nasyca miejsca wiązania na wszystkich cząsteczkach GTPazy.
Podziel to rozwiązanie równo na wiele rur. Dodaj drugiego partnera interakcji - fluorescencyjnie znakowane białko B - do probówek w coraz większych ilościach. Inkubować pod wpływem mieszania.
Białko B wiąże się z tym samym miejscem wiązania w GTPazach — kompetycyjnie wypierając białko A.
Wystaw rurki na działanie pola magnetycznego, aby zebrać koraliki z jednej strony. Odrzucić sklarowany nad osadem w celu usunięcia niezwiązanych białek. Ponownie zawiesić kulki skompleksowane białkami w odpowiednim buforze i określić ilościowo związane białka.
Wykreślić względne intensywności białek A i B związanych z GTPazą przy każdym stężeniu białka B.
Białko B osiąga równowagę – zajmując miejsca wiązania połowy cząsteczek GTPazy – w stosunkowo niższym stężeniu niż białko A, co wskazuje na większe powinowactwo białka B do GTPazy.
Aby wykonać wiązanie konkursowe, ustaw sześć probówek do mikrofug, z których każda zawiera 200 mikrolitrów buforu wiążącego konkurencję. Każda probówka powinna również zawierać 10 mikrolitrów kulek Rac1 obciążonych nukleotydami i pięć mikrolitrów białka A wiążącego Rac1 jako białka o stałym wiążącym.
Do każdej probówki dodaj 0, 1, 2,5, 5, 10 lub 20 mikrolitrów białka B wiążącego Rac1 jako białka wiążącego o zmiennej charakterystyce. Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia stałych i zmiennych białek wiążących i mogą wymagać dostosowania.
Uzupełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 mikrolitrów przez dodanie konkurencyjnego buforu wiążącego. Następnie ustaw probówkę do mikrofugi zawierającą 200 mikrolitrów buforu konkurencji, 10 mikrolitrów eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami i 10 mikrolitrów białka A wiążącego Rac1.
Następnie skonfiguruj probówki kontrolne GDP, GTPγS i bez nukleotydów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubować probówki przez dwie godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć koraliki trzykrotnie buforem wiążącym konkurencję.
Na koniec wymyj związane białka w 20 mikrolitrach redukującego buforu próbki.