Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Rozpocznij test mikromacierzy antygenu wirusowego od przygotowanego szkiełka z mikromacierzy antygenu wirusowego.

Szkiełko zawiera wiele podkładek, z których każda ma pojedynczą matrycę zawierającą setki oczyszczonych antygenów wielu szczepów wirusa wydrukowanych na plamkach ułożonych w siatkę. Każda plamka zawiera pojedynczy typ antygenu zaadsorbowany na trójwymiarowej mikroporowatej powierzchni nitrocelulozy.

Zamocuj suwak w komorze, aby ułatwić obsługę podczas kolejnych kroków. Dodaj bufor blokujący zawierający białka, które wiążą się z pozostałymi powierzchniami szkiełka, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z powierzchnią.

Inkubować szkiełko do mikromacierzy z rozcieńczoną surowicą ludzką. Izotypy przeciwciał w surowicy, specyficzne dla antygenów na szkiełku, rozpoznają epitopy antygenów i wiążą się z nimi.

Usuń serum. Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i białek ze szkiełka.

Dodaj mieszaniny przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z kropkami kwantowymi, z których każda ma inną kropkę kwantową. Przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla danej izotypu wiążą się specyficznie z odpowiednim izotypem przeciwciała surowicy związanym z antygenami na szkiełku.

Użyj imagera do mikromacierzy, aby określić ilościowo wiązanie przeciwciał z antygenami w szkiełku mikromacierzy.

Po wzbudzeniu na odpowiednich długościach fal kropki kwantowe związane z przeciwciałami wtórnymi powracają do stanu podstawowego i emitują specyficzne sygnały fluorescencyjne, które są wykrywane przez fotodetektor.

Intensywność fluorescencji punktowej określa ilościowo izotyp przeciwciał w surowicy w surowicy związanej z indywidualnym antygenem.

Po zaprogramowaniu oprogramowania drukującego z żądanym protokołem rozpocznij drukowanie. Po zakończeniu umieść niesondowane szkiełka mikromacierzy w odpornym na światło pudełku w szafie eksykatora w temperaturze pokojowej.

Aby sondować surowice pod kątem przeciwciał w mikromacierzy, użyj klipsów, aby przymocować szkiełka do mikromacierzy stroną do góry na komorach sondujących i umieść komory w ramkach.

Zachowaj ostrożność podczas montażu prowadnic, ponieważ łatwo się łamią, i sprawdź, czy nie ma wycieków po ponownym nawodnieniu. W razie potrzeby zdemontuj i ponownie zmontuj prowadnice, aby naprawić nieszczelności.

Ponownie uwodnić szkiełka za pomocą 100 mikrolitrów przefiltrowanego buforu blokującego na studzienkę i rozcieńczyć surowicę w stosunku 1 do 100 w 100 mikrolitrach buforu blokującego na próbkę. Następnie inkubować ponownie uwodnione szkiełka mikromacierzy i rozcieńczone surowice przez 30 minut w temperaturze pokojowej i od 100 do 250 obrotów na minutę na wytrząsarce orbitalnej.

Pod koniec inkubacji użyć końcówek pipet połączonych z przewodem próżniowym z wtórną kolbą zbiorczą, aby ostrożnie zassać bufor blokujący z rogu każdej komory, nie dotykając elektrod, i natychmiast dodać rozcieńczoną surowicę do elektrod, nie dopuszczając do wyschnięcia elektrod. Następnie umieść przykryte ramki na tacach zawierających wilgotne ręczniki papierowe szczelnie zamknięte w celu utrzymania wilgotności i inkubuj ramki przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na kołyszącym się shakerze.

W celu znakowania przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z kropkami kwantowymi, ostrożnie odessać surowice, jak właśnie pokazano, i przepłukać szkiełka trzema płukaniami w 100 mikrolitrach świeżego buforu T-TBS na studzienkę przez 5 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej. Szkiełka są następnie inkubowane z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z kropkami kwantowymi, a następnie przemywane trzykrotnie, jak opisano w protokole, przy użyciu tej samej techniki, jak właśnie pokazano.

Po ostatnim umyciu ostrożnie wyjmij szkiełka z komór i delikatnie spłucz szkiełka przefiltrowaną wodą podwójnie destylowaną, a następnie umieść każde szkiełko w 50-mililitrowej probówce. Następnie wysuszyć szkiełka przez odwirowanie.

Aby uzyskać obrazy szkiełek z mikromatrycą, najpierw włącz przenośny imager i ostrożnie umieść szkiełko, które ma być obrazowane, stroną zadrukowaną w uchwycie szkiełek w komorze obrazowania. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i w zakładce "Konfiguruj imager" wybierz odpowiednią konfigurację slajdu.

W zakładce "Image Control" wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj czas ekspozycji i akwizycji w zależności od reaktywności sera. Następnie kliknij "Przechwyć", aby rozpocząć pobieranie obrazu. Pod koniec akwizycji użyj siatek zorientowanych na znacznikach odniesienia, aby wykryć plamy tablicy.