Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

Monocyty to komórki odpornościowe, które różnicują się w makrofagi i komórki dendrytyczne prezentujące antygen w celu ochrony przed infekcją.

Aby wyhodować monocyty i wywołać ich różnicowanie in vitro, należy rozpocząć od pobrania zawiesiny pierwotnych monocytów ludzkich w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Dodaj zawiesinę komórkową do studzienek płytki hodowlanej. Inkubować w warunkach fizjologicznych, aby komórki mogły przylegać.

Dodaj cytokiny indukujące różnicowanie - czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów lub GM-CSF do jednego dołka i czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów lub M-CSF do innego. Inkubować przez odpowiedni czas.

GM-CSF wiąże się ze swoim receptorem heterodimerycznym na komórkach i indukuje różnicowanie monocytów. Wiązanie GM-CSF powoduje aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, co prowadzi do ekspresji genów do przygotowania do fenotypu podobnego do makrofagów M1.

Komórki podobne do M1 - zaokrąglone komórki o dużej objętości cytoplazmatycznej - są prozapalne i pomagają w obronie przed infekcją.

W drugiej studzience M-CSF wiąże się ze swoim receptorem homodimerycznym na monocytach i indukuje różnicowanie komórek. Wiązanie M-CSF powoduje aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych innych niż GM-CSF, co prowadzi do ekspresji genów do przygotowania do fenotypu podobnego do makrofagów M2.

Komórki podobne do M2 - o wydłużonym kształcie - działają przeciwzapalnie i wykazują funkcje przebudowy i naprawy tkanek.

Zróżnicowane komórki makrofagów są gotowe do dalszych testów.

Po zliczeniu ponownie zawiesić wyizolowane monocyty w 1 razy 10 do szóstych komórek na mililitr pożywki RPMI 1640 o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez surowicy uzupełnionej antybiotykami, a następnie podać 1 mililitr komórek do ponownego zawieszenia na 35-milimetrowych płytkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 do 60 minut, aby komórki mogły przylgnąć do dna studzienki.

Aby przygotować makrofagi o fenotypie podobnym do M1, dodaj 100 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej zawierającej 25 nanogramów na mililitr GM-CSF do każdej płytki. Aby przygotować makrofagi o fenotypie podobnym do M2, dodaj 100 mikrolitrów bydlęcego płodu zawierającego 50 nanogramów na mililitr M-CSF do każdej płytki.