Izolacja makrofagów z ganglionu korzenia grzbietowego myszy za pomocą dysocjacji mechanicznej

Zwój korzenia grzbietowego lub DRG to skupisko komórek nerwowych wzdłuż rdzenia kręgowego, które przenoszą informacje czuciowe z obwodowego do ośrodkowego układu nerwowego. Uszkodzenie nerwów obwodowych powoduje akumulację makrofagów w DRG i rozwój bólu neuropatycznego.

Aby wyizolować żywotne makrofagi metodą bezenzymatyczną, należy wziąć świeżo wypreparowaną tkankę DRG myszy w homogenizatorze wypełnionym lodowatym buforem, aby ograniczyć stres komórkowy. Za pomocą tłuczka mechanicznie zhomogenizuj tkankę, aby uwolnić komórki.

Przefiltrować przez sitko komórkowe w celu usunięcia grudek komórek i uzyskania zawiesiny jednokomórkowej w przepływie. Homogenat tkankowy zawiera neurony i komórki nieneuronalne, do których należą makrofagi i swobodnie unosząca się mielina - osłonka izolacyjna neuronów.

Dodać przefiltrowany homogenat do probówki zawierającej pożywkę o gradiencie gęstości i odwirować. Pod wpływem siły odśrodkowej żywotne komórki o większej gęstości wyporu osiadają na dnie rurki, tworząc osad, podczas gdy mielina pozostaje zawieszona. Odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w buforze zawierającym przeciwciała sprzężone z fluoroforem przeciwko specyficznym dla makrofagów receptorom na powierzchni komórki. Inkubować przez wymagany czas. Przeciwciało wiąże się ze swoim receptorem na komórkach makrofagów, znakując w ten sposób fluorescencyjnie powierzchnię komórki. Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego. Sygnał fluorescencyjny specyficzny dla przeciwciała wskazuje na obecność makrofagów w próbce.

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór roboczy pożywki o gradiencie gęstości, mieszając dziewięć objętości pożywki z jedną objętością 10X HBSS bez wapnia i magnezu i trzymać go na lodzie. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przez brak reakcji na uszczypnięcie tylnej łapy.

Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy w chemicznym okapie oparowym w pozycji leżącej na plecach z czterema łapami zabezpieczonymi taśmą. Za pomocą kleszczy podnieś skórę poniżej klatki piersiowej, a następnie nożyczkami chirurgicznymi wykonaj małe nacięcie, aby odsłonić wątrobę i przeponę. Za pomocą tych samych nożyczek przetnij przeponę i klatkę piersiową, a następnie otwórz jamę opłucnej, aby odsłonić bijące serce.

Następnie nożyczkami do tęczówki szybko odetnij prawy uszek przedsionkowy. Po zauważeniu krwawienia włóż igłę o rozmiarze 30 do tylnego końca lewej komory i powoli wstrzyknij 10 mililitrów wstępnie schłodzonego 1X PBS, aby wykonać perfuzję zwierzęcia.

Aby wykonać laminektomię grzbietową, umieść mysz w pozycji leżącej. Użyj skalpela w rozmiarze 11, aby wykonać dwa podłużne boczne głębokie nacięcia, zaczynając od okolicy piersiowej w dół do okolicy krzyżowej. Następnie usuń skórę odsłaniającą warstwę mięśni grzbietowych. Następnie, za pomocą Friedmana-Pearsona Rongeura, oderwij tkanki łączne i mięśnie, aż do odsłonięcia wyrostków kręgosłupa lędźwiowo-krzyżowego i obustronnych wyrostków poprzecznych.

Najpierw użyj Friedmana-Pearsona Rongeur, aby ostrożnie otworzyć grzbietowy kręgosłup. Następnie przełącz się między nożyczkami Friedman-Pearson Rongeur i Noyes Spring, aby usunąć kości kręgów, odsłaniając rdzeń kręgowy z przyczepionymi nienaruszonymi nerwami rdzeniowymi. Ostrożnie przeanalizuj ipsilateralny i przeciwległy DRG lędźwiowy.

Umieść go w 1 mililitrze lodowatego 1X HBSS bez wapnia i magnezu w homogenizatorze tkankowym Dounce. Homogenizuj tkankę DRG w homogenizatorze Dounce za pomocą luźnego tłuczka od 20 do 25 razy. Umieść sterylne sitko nylonowe o grubości 70 mikrometrów w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Użyj 800 mikrolitrów lodowatego 1X HBSS, aby zwilżyć sitko do komórek.

Za pomocą pipety zebrać homogenizowaną zawiesinę tkankową z homogenizatora na sitko z mokrymi komórkami i zebrać ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz homogenizator dwukrotnie 800 mikrolitrami lodowatego 1X HBSS, zbierając płyn do tej samej 50-mililitrowej stożkowej probówki, aby zwiększyć wydajność.

Dodaj 1,5 mililitra zrównoważonego, lodowatego, izotonicznego gradientu gęstości do sterylnej 5-mililitrowej probówki FACS z polistyrenu. Przenieś homogenat komórek z 50-mililitrowej stożkowej probówki do tej probówki FACS i pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.

Dodaj dodatkowe 500 mikrolitrów 1X HBSS, aby uszczelnić górę. Odwirować komórki w temperaturze 800 razy g przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ostrożnie odessać supernatant zawierający mielinę w pożywce, nie naruszając osadu komórkowego znajdującego się na dnie probówki.

Dodać 100 mikrolitrów PBS zawierających 5% płodowej surowicy bydlęcej do osadu i ponownie zawiesić komórki DRG. Następnie dodaj do komórek przeciwciało alfa-myszy CX3CR1-APC i inkubuj w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 1 godzinę.

Umyj komórki raz 5 mililitrami PBS. Odwiruj komórki w temperaturze 360 razy g przez 8 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 mikrolitrach PBS do analizy FACS.