Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z ludzkich płaszczy kożucha

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, PBMC, składają się z niejednorodnej populacji wyspecjalizowanych komórek odpornościowych, w tym limfocytów, monocytów i komórek dendrytycznych.

Aby wyizolować PBMC, należy rozpocząć od probówki zawierającej świeżo uzyskaną ludzką krew kożuchówki. Krew kożucha zawiera PBMC wraz z granulocytami z wielopłatkowymi jądrami, erytrocytami i płytkami krwi zawieszonymi w osoczu.

Ostrożnie nałożyć zawiesinę kożucha na równą objętość podłoża o gradiencie gęstości o pożądanej gęstości właściwej, która jest optymalna do separacji PBMC.

Podczas wirowania różne typy komórek rozdzielają się na odrębne warstwy, w oparciu o gęstość komórek w stosunku do podłoża gradientowego. Dodatkowo polisacharydy w pożywce o gradiencie gęstości sprzyjają agregacji erytrocytów i sedymentacji.

Erytrocyty i granulocyty o większej gęstości osadzają się na dnie probówki, podczas gdy osocze o najmniejszej gęstości tworzy najwyższą warstwę. PBMC, które mają niższą gęstość niż ośrodek gradientu gęstości, tworzą mętną białą warstwę na granicy faz ośrodka gradientu gęstości plazmy.

Usuń górną warstwę plazmy. Ostrożnie zebrać mętną warstwę zawierającą PBMC i przenieść ją do świeżej probówki z podłożem niezawierającym surowicy. Odwirować w celu osadzenia PBMCs. Odrzucić supernatant zawierający płytki krwi i pozostałą pożywkę gradientową.

Zawiesić PBMC w świeżej pożywce i użyć do dalszej analizy.

Aby wyizolować PBMC z ludzkich kożuchów kożuchowych, użyj pipety, aby powoli nałożyć 15 milimetrów krwi kożucha po boku 50-mililitrowej probówki na 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości i oddzielić komórki przez wirowanie. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć górną warstwę osocza i ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej 50-mililitrowej probówki.

Dodaj pożywkę RPMI bez surowicy do komórek do końcowej objętości 50 mililitrów i delikatnie odwróć probówkę kilka razy przed odwirowaniem. Następnie ponownie zawieś komórki w 20 mililitrach pożywki bez surowicy w celu zliczenia.