Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów

Aby wywołać odpowiedź immunologiczną, komórki dendrytyczne, DC, prezentują antygen wyświetlany z MHC klasy II i cząsteczkami kostymulującymi CD80 i CD86. Na podstawie charakterystyki odpowiedzi immunologicznej dzieli się je na niedojrzałe, dojrzałe i tolerogenne DC.

Aby wygenerować różne podzbiory komórek dendrytycznych in vitro, należy rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej ludzkie monocyty - immunologiczne komórki prekursorowe w kompletnej pożywce zawierającej czynniki wzrostu i cytokinę IL-4 - cząsteczkę sygnałową.

Inkubuj komórki przez dłuższy czas. Czynniki wzrostu i IL-4 indukują proliferację i różnicowanie monocytów w niedojrzałe DC.

Niedojrzałe DC posiadają receptory rozpoznawania wzorców, PRR i wyrażają cząsteczki o niskiej klasie MHC II i cząsteczki kostymulujące, wykazując zmniejszoną zdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej.

Leczyć jeden dobrze zawierający niedojrzałe DC środkami immunomodulującymi - witaminą D3 i glikokortykosteroidami. Te leki immunomodulujące obniżają ekspresję MHC klasy II i cząsteczek kostymulujących. Prowadzi to do różnicowania się w tolerogenne DC – komórki immunoregulacyjne, które zapobiegają nadmiernej lub niepożądanej odpowiedzi immunologicznej.

Potraktuj inną studzienkę zawierającą niedojrzałe DC lipopolisacharydem, LPS - antygenem. LPS oddziałuje z receptorem toll-like 4 komórek - PRR, inicjuje kaskadę sygnałową i różnicuje je w dojrzałe komórki. Komórki te wyrażają wysoki poziom MHC klasy II, cząsteczki kostymulujące i PRR - skuteczne w przetwarzaniu i prezentacji antygenu.

Obserwuj studzienki poddane zróżnicowanej obróbce pod kątem odrębnych cech morfologicznych reprezentujących podtypy komórek dendrytycznych.

Wysiewaj cztery zestawy monocytów CD14 + w stężeniu od 0,3 do 0,5 x 10⁶ na mililitr pożywki do hodowli komórkowej IL-4 na płytkach sześciodołkowych. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO₂ . W dniu 4 usuń 850 mikrolitrów pożywki z kultury i odwiruj.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze pożywki do hodowli komórkowych. Dodaj mieszaninę komórek z powrotem do hodowli. W dniu 5 dodaj 1 mikrolitr bulionu witaminy D3 i 1 mikrolitr bulionu deksametazonu na mililitr pożywki do dwóch zestawów, aby wytworzyć tolerogenne moDC.

W dniu 6 dodaj 200 nanogramów na mililitr GM-CSF i 200 nanogramów na mililitr IL-4 do wszystkich zestawów. Dodaj 1 mikrogram na mililitr LPS do jednego z zestawów traktowanych tylko GM-CSF i IL-4, aby wygenerować dojrzałe moDC.

Dodaj 1 mikrogram na mililitr LPS do jednego zestawu modów tolerogennych moDC, aby wygenerować moDC tolerogenne LPS. Na koniec, w dniu 7, zbierz różne rodzaje moDC, przepłukując naczynie hodowlane PBS-EDTA.