JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:58 min. • July 8th, 2025
Aby przeprowadzić immunomagnetyczną ujemną separację komórek B, zbierz ludzką krew obwodową do probówki zawierającej antykoagulant, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Dodaj czerwone krwinki, RBC, bufor do lizy, aby lizować krwinki czerwone bez wpływu na inne komórki krwi.
Odwirować w celu osadzenia nienaruszonych, gęstszych komórek krwi z mniej gęstych zlizowanych krwinek czerwonych, które pozostają w supernatancie. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w świeżym podłożu.
Przenieś komórki na płytkę hodowlaną. Inkubować, aby makrofagi i monocyty przylegały do płytki, podczas gdy nieprzylegające komórki, w tym limfocyty B, pozostają w zawiesinie.
Zebrać komórki w zawiesinie do świeżej probówki. Odwirować w celu osadzenia komórek i ponownego ich zawieszenia w buforze.
Dodać roztwór koktajlowy zawierający biotynylowane przeciwciała specyficzne dla komórek krwi innych niż limfocyty B. Przeciwciała wiążą się z antygenami na powierzchni komórek innych niż B, pozostawiając limfocyty B nieznakowane.
wirówka. Odrzucić supernatant zawierający niezwiązane przeciwciała.
Dodać roztwór kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną. Podczas inkubacji streptawidyna na mikrogranulkach ściśle wiąże się z biotynylowanymi przeciwciałami związanymi z komórkami innymi niż B, tworząc kompleksy.
Umieść rurkę w polu magnetycznym, aby przykleić komórki inne niż B związane z kulkami magnetycznymi do ścianek rurki, pozostawiając komórki B w zawieszeniu. Przenieść supernatant zawierający czyste limfocyty B do probówki.
Odwirować i ponownie zawiesić limfocyty B w pożywce w celu dalszej analizy.
Natychmiast po pobraniu 10-mililitrowej próbki krwi z środkowej żyły łokciowej do 15-mililitrowej probówki zawierającej EDTA uzupełnionego potasem, należy kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów. Następnie dodaj 35 mililitrów autoklawowanego buforu do lizy czerwonych krwinek do komórek na 5-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Gdy przez probówkę można zaobserwować światło, odwiruj krew i potwierdź obecność białego osadu. Usuń resztkowy bufor do lizy z 10 mililitrami autoklawu do PBS i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach pożywki RPMI 1640.
Umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie delikatnie zakręć kilka razy naczyniem hodowlanym i przenieś pływające komórki do plastikowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.
Po dwóch płukaniach przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad w stężeniu 5 do 10 x10 6 komórek na mililitr w 200 mikrolitrach zimnego buforu PBS i dodać 5 mikrolitrów biotynylowanego koktajlu przeciwciał anty-ludzkich specyficznego dla komórek krwi na 1 x 106 komórek.
Po 30-minutowej inkubacji na lodzie umyj komórki w 10-krotnie nadmiarowej objętości sterylnego PBS i ponownie zawieś osad w 5 mikrolitrach mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną na 1 x 106 komórek na 30-minutową inkubację na lodzie. Pod koniec inkubacji dodać 2 mililitry buforu PBS do komórek i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na 8 minut w temperaturze pokojowej.
Gdy mikrogranulki przyczepią się do ścianki probówki, ostrożnie przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki i dodaj 2 dodatkowe mililitry buforu PBS do komórek. Po drugim pobraniu supernatantu zebrać połączone komórki przez odwirowanie i przenieść komórki do 5-mililitrowej probówki polistyrenowej w świeżym buforze PBS o stężeniu 1 x10,7 komórek na mililitr
.