Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Limfocyty B wydzielające przeciwciała lub ASC to zróżnicowane limfocyty B, które wydzielają izotypy przeciwciał, w tym IgG i IgM, w celu zapewnienia ochrony przed patogenami.

Aby przeprowadzić ocenę funkcjonalną ASC in vitro, należy rozpocząć od testu punktowego immunoenzymu. Weź płytkę ELISpot zawierającą u podstawy aktywowaną membranę z polifluorku winylidenu.

Inkubować studzienki z fragmentami przeciwciał poliklonalnych zawierającymi wyłącznie regiony Fab bez regionu Fc przeciwciała. Każdy region Fab ma miejsce wiązania dla określonych izotypów przeciwciał — IgG lub IgM, co umożliwia identyfikację obu izotypów.

Podczas inkubacji fragmenty przeciwciał przyczepiają się do błony, co prowadzi do unieruchomienia.

Załóż studzienki roztworami blokującymi, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Wysiewaj płytkę aktywowanymi komórkami B wydzielającymi przeciwciała i inkubuj. ASC wydzielają różne izotypy, w tym IgG i IgM, które wiążą się z fragmentami przeciwciał związanymi z błoną.

Przemyć płytkę buforem w celu usunięcia niezwiązanych wydzielanych przeciwciał. Potraktuj niektóre studzienki sprzężonymi z enzymami przeciwciałami wykrywającymi IgM, a inne przeciwciałami wykrywającymi IgG i inkubuj.

Przeciwciała detekcyjne wiążą się z odpowiednimi izotypami, tworząc immunokompleksy.

Dodaj podłoża kolorymetryczne do wszystkich studzienek, które wchodzą w interakcję z enzymami i wytwarzają fioletowe plamy na membranie. Dodaj roztwór zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję.

Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, korelującego z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Po zebraniu wszystkich komórek należy zasiać podzbiory do indywidualnych dołków 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w stężeniu od 1 do 10 x^{10 5} komórek na mililitr w świeżej pożywce RPMI. Następnie aktywuj limfocyty B za pomocą 5 mikrogramów CpG (ODN 2006) na 1 x 10⁶ komórek na mililitr na studzienkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez pięć dni.

Pod koniec aktywacji dodaj 30 mikrolitrów 35% etanolu w wodzie destylowanej do każdej studzienki płytek ELISpot na 30 sekund. Następnie zastąp etanol w każdej studzience 150 mikrolitrami autoklawowanej podwójnie destylowanej wody i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby usunąć resztki etanolu. Wykonać płukanie PBS, a następnie dodać 50 mikrolitrów poliklonalnego fragmentu F(ab')2 anty-ludzkiego Ig do każdej studzienki.

Umyj płytki dwa razy PBS, jak właśnie pokazano. Zablokować niespecyficzne wiązanie w każdym dołku za pomocą 200 mikrolitrów świeżego PBS z BSA przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po kolejnej serii płukania PBS inkubuj studzienki w 100 mikrolitrach świeżej pożywki RPMI 1640 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zastąp pożywkę w każdej studzience ELISpot odpowiednią liczbą aktywowanych limfocytów B.

Doprowadź końcową objętość każdej studzienki do 150 mikrolitrów za pomocą świeżej pożywki RPMI. Następnie umieść płytkę ELISpot z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na 8 do 14 godzin. Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i umyć studzienki 200 mikrolitrami PBS plus Tween 20 przez pięć 3-minutowych płukań.

Po ostatnim przemyciu dodać odpowiednie przeciwciała wykrywające do odpowiednich studzienek i inkubować płytki przez dwie godziny w ciemności. Po kolejnej serii płukania PBS dodaj 50 mikrolitrów substratu BCIP/NBT do każdej studzienki przez 5 do 15 minut w temperaturze pokojowej.

Gdy pojawią się fioletowe plamy, przerwij reakcję 100 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody na studzienkę i spłucz płytkę bieżącą wodą z kranu. Następnie wysuszyć na powietrzu membrany ELISpot chronione przed światłem.