JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:03 min • July 8th, 2025
Adipocyty, czyli komórki magazynujące tłuszcz, są dominującymi komórkami tkanki tłuszczowej - które wydzielają adipokiny - cząsteczki sygnalizacji immunologicznej, które regulują odpowiedź immunologiczną.
Aby wygenerować adipocyty in vitro, zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej przylegającą hodowlę komórek zrębu szpiku kostnego myszy, BMSC — niezróżnicowanych komórek multipotencjalnych.
Potraktuj komórki pożywką do indukcji adipocytów zawierającą inhibitory enzymów fosfodiesterazy i deksametazon - syntetyczny glikokortykosteroid - w celu wywołania różnicowania komórek.
Inhibitory wnikają do komórek i dezaktywują fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów, enzymy niezbędne do rozkładu cyklicznego monofosforanu adenozyny lub cAMP. To hamowanie powoduje zwiększenie wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP, krytycznego dla różnicowania komórek.
Deksametazon wiąże się z receptorami wewnątrzkomórkowymi w BMSC i dostaje się do jądra w celu aktywacji genów zaangażowanych w syntezę i akumulację lipidów. Indukuje to różnicowanie BMSC w preadipocyty - komórki prekursorowe dla dojrzałych adipocytów.
Zastąp zużytą pożywkę świeżą pożywką indukcyjną, aby utrzymać preadipocyty. Po określonym czasie potraktuj komórki pożywką bazową adipocytów zawierającą wysoką glukozę i insulinę.
Insulina wiąże się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórki i aktywuje translokację transporterów glukozy na powierzchni komórki, ułatwiając wychwyt glukozy do preadipocytów. Komórki wykorzystują nadmiar glukozy do syntezy kropelek lipidów, co prowadzi do adipogenezy - procesu akumulacji lipidów - który sprzyja różnicowaniu się w dojrzałe adipocyty.
Potraktuj komórki barwnikiem barwiącym lipidy i obserwuj je pod mikroskopem świetlnym. Dojrzałe adipocyty pojawiają się jako okrągłe komórki z wieloma czerwonymi kropelkami lipidów.
Aby indukować różnicowanie adipocytów komórek macierzystych szpiku kostnego, należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej zlewającej się hodowli komórek szpiku kostnego pożywką do indukcji adipocytów. Po dwóch dniach hodowli zastąpić supernatant świeżą pożywką do indukcji adipocytów, zmieniając pożywkę na bazie adipocytów w 4 dniu. W 7 dniu potwierdź, że komórki zgromadziły kropelki lipidów i że fenotyp jest podobny do dojrzałych adipocytów.