Hodowla aktywowanych limfocytów T z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:25 min • July 8th, 2025
Wiele interakcji receptor-ligand na powierzchni komórki między naiwnymi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen, APC, wywołują aktywację i proliferację limfocytów T.
Dwa podstawowe zdarzenia w tym procesie obejmują rozpoznanie antygenu wyrażonego przez APC przez kompleks receptora limfocytów T CD3, a następnie interakcję między ligandem B7 z ekspresją APC a receptorem limfocytów T CD28.
Aby zbadać aktywację i proliferację limfocytów T in vitro, należy pobrać ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, PBMC, zawieszone w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Dodaj kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 i podziel komórki na dwie stożkowe rurki.
Dodaj cytokinę interleukinę-2, IL-2 do pierwszej probówki, a interleukinę-15, IL-15 do drugiej. Przenieść komórki na płytkę wielodołkową. Inkubować.
Przeciwciała anty-CD3 i anty-CD28 kulek wiążą się odpowiednio z kompleksem receptora limfocytów T CD3 i receptorem CD28 ulegającym ekspresji na limfocytach T, powodując aktywację i proliferację limfocytów T.
W przypadku IL-2 cytokina wiąże się ze swoim receptorem na aktywowanej powierzchni limfocytów T, co prowadzi do ich różnicowania i proliferacji do efektorowych limfocytów T. I odwrotnie, IL-15 przede wszystkim napędza różnicowanie i proliferację limfocytów T pamięci.
Ponownie zawieś i przenieś połowę komórek do nowych studzienek, aby umożliwić wzrost komórek. Dodaj świeżą pożywkę zawierającą IL-2 lub IL-15, aby utrzymać populacje limfocytów T różnicowanych cytokinami do późniejszej analizy.
Na początek umyj kulki CD3/CD28, przenosząc 12,5 mikrolitra kulek na milion komórek do probówki mikrowirówki i dodając 12,5 mikrolitra PBS na 12,5 mikrolitra kulek w probówce. Następnie umieść probówkę mikrowirówki na odpowiednim magnesie na 1 minutę, wyrzuć bufor i ponownie zawieś kulki w pierwotnej objętości pożywki z komórek T.
Następnie dodaj 12,5 mikrolitra koralików na milion komórek w stosunku 1 do 2 kulek do komórek i podziel komórki na dwa warunki, z których każdy ma około 5 milionów komórek. Następnie dodaj odpowiednią objętość cytokin do każdego warunku i przenieś komórki na płytki wielodołkowe. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po trzech dniach inkubacji przygotuj świeżą pożywkę z limfocytów T o podwójnym stężeniu cytokin. Ponownie zawieś i podziel komórki, przenosząc połowę objętości z każdej studzienki do nowej studzienki. Następnie dodaj taką samą objętość świeżo przygotowanej pożywki z komórek T do każdego dołka.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje aktywację i proliferację limfocytów T poprzez oddziaływania receptor-ligand z komórkami prezentującymi antygen (APC). Metodyka obejmuje hodowlę mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) człowieka oraz wykorzystanie specyficznych przeciwciał i cytokin w celu stymulacji odpowiedzi limfocytów T.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia limfocytów T
- Techniki hodowli komórkowych
Wstęp
- Naiwne limfocyty T wymagają aktywacji, aby proliferować i różnicować się.
- Kompleks receptora CD3 oraz receptor CD28 odgrywają kluczowe role w aktywacji limfocytów T.
- Cytokiny takie jak IL-2 i IL-15 wpływają na los limfocytów T.
- Zrozumienie tych procesów jest niezbędne dla badań immunologicznych i terapii.
Cel badania
- Wyjaśnienie mechanizmów aktywacji i proliferacji limfocytów T.
- Porównanie wpływu IL-2 i IL-15 na różnicowanie limfocytów T.
- Ustanowienie wiarygodnego modelu in vitro do badania odpowiedzi limfocytów T.
Zastosowane metody
- Izolacja PBMC z krwi ludzkiej.
- Powlekanie kulek magnetycznych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28.
- Kultura limfocytów T z IL-2 lub IL-15 w płytkach wielodołkowych.
- Inkubacja w kontrolowanych warunkach w celu promowania wzrostu komórek.
Główne wyniki
- Osiągnięto skuteczną aktywację i proliferację limfocytów T.
- IL-2 promowała różnicowanie w efektorowe limfocyty T.
- IL-15 stymulowała przede wszystkim powstawanie limfocytów T pamięci.
- Wzrost komórek utrzymywano poprzez suplementację cytokinami.
Wnioski
- Badanie dostarcza informacji na temat mechanizmów aktywacji limfocytów T.
- Różne cytokiny pełnią odmienne role w różnicowaniu limfocytów T.
- Ten model in vitro może zostać wykorzystany w dalszych badaniach immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajna aktywacja i różnicowanie ludzkich limfocytów T z PBMC ex vivo stanowią podstawę odkrywania leków opartych na immunologii oraz badań translacyjnych. Niniejszy protokół umożliwia standaryzowane generowanie populacji efektorowych i pamięciowych limfocytów T, co zwiększa wiarygodność predykcyjną we wczesnych etapach walidacji celów terapeutycznych i przesiewów funkcjonalnych. Niezawodne systemy hodowli limfocytów T są kluczowe dla minimalizacji ryzyka w strategiach immunomodulacyjnych i podejmowania decyzji dotyczących rozwoju portfolio w ramach programów immunoterapii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek aktywacji limfocytów T oraz funkcjonalnego zaangażowania celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnienie odpowiedzi efektorowych od odpowiedzi pamięciowych limfocytów T.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów immunomodulujących.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne populacje limfocytów T do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Standaryzuje warunki aktywacji i różnicowania w celu zapewnienia porównywalności testów.
- Umożliwia ilościową ocenę wpływu związków na proliferację i fenotyp limfocytów T.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie różnicowania limfocytów T in vitro do fenotypów immunologicznych istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość badań od etapu odkryć po przedkliniczne badania immunologiczne.
- Minimalizuje ryzyko w procesie translacyjnym poprzez modelowanie biologii efektorowych i pamięciowych limfocytów T.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół hodowli limfocytów T integruje wczesny etap procesu od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, screening oraz modelowanie translacyjne odpowiedzi immunologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne nad aktywacją limfocytów T i różnicowaniem napędzanym cytokinami.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, różnicowanych cytokinami limfocytów T do funkcjonalnej oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar proliferacji limfocytów T i zmian fenotypowych.
- Badania translacyjne: Modeluje odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T istotne dla rozwoju immunoterapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną platformę do powtarzalnych testów opartych na komórkach odpornościowych w różnych programach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów immunologicznych i przesiewaniu funkcjonalnym.
- Wartość operacyjna: Poprawia odtwarzalność i skalowalność testów opartych na limfocytach T.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dla zasobów immunomodulacyjnych poprzez redukcję niejednoznaczności biologicznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów ukierunkowanych immunologicznie z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji ludzkich PBMC oraz w technikach hodowli limfocytów T.
- Wymaga dostępu do odczynników aktywujących opartych na kuleczkach magnetycznych oraz suplementacji cytokinami.
- Wymaga standaryzacji protokołów aktywacji i różnicowania pomiędzy zespołami.
- Może być konieczna adaptacja w zależności od źródeł dawców lub modeli chorób.
- Powtarzalność zależy od stałej jakości cytokin oraz sposobu obchodzenia się z komórkami.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Monitorowanie oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych cytokinami
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026