JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:07 min. • July 8th, 2025
Megakariocyty to duże, wielojądrzaste komórki, które dają początek płytkom krwi, które są niezbędne do krzepnięcia krwi.
Aby wytworzyć płytki krwi in vitro, należy pobrać hodowlę zawiesinową hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, HSPC, pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej.
Dodaj trombopoetynę i inkubuj w warunkach fizjologicznych. Trombopoetyna wiąże się ze swoim receptorem na HSPC, wywołując zdarzenia sygnalizacyjne, które prowadzą do różnicowania HSPC w niedojrzałe megakariocyty.
Niedojrzałe komórki przechodzą proces dojrzewania, tworząc dojrzałe megakariocyty. Dojrzałe komórki są duże i zawierają cytoplazmatyczne ziarnistości wydzielnicze. Posiadają wielopłatkowe jądro poliploidalne i wgłębiony system błonowy w cytoplazmie.
Dojrzałe megakariocyty wytwarzają długie, cienkie wypustki cytoplazmatyczne — propłytki. Propłytki - liczne obrzęki wielkości płytek krwi połączone cienkimi mostkami cytoplazmatycznymi - są uwalniane do pożywki.
Mostki cytoplazmatyczne pękają, powodując uwalnianie pojedynczych płytek krwi. Odwirować, aby uzyskać płytki krwi w postaci granulek. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze zawierającym difosforan adenozyny - do aktywacji płytek krwi - i przeciwciała znakowane fluorescencyjnie - w celu identyfikacji aktywowanych płytek krwi.
Difosforan adenozyny wiąże się ze specyficznymi receptorami sprzężonymi z białkiem G na płytkach krwi. Wiązanie inicjuje kaskadę sygnalizacyjną, prowadzącą do aktywacji płytek krwi. Aktywacja indukuje sygnalizację wewnątrzkomórkową, która aktywuje kompleks integrynowy na błonie płytek krwi. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie wiążą się z aktywowanym kompleksem.
Przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność sygnału fluorescencyjnego specyficznego dla przeciwciała wskazuje na aktywowane płytki krwi.
W celu różnicowania megakariocytów wysiewaj 5 x 105 komórek CD34 dodatnich na mililitr w 2 mililitrach pożywki bez surowicy, uzupełnionej rekombinowaną ludzką trombopoetyną na studzienkę, na 12-dołkowej płytce do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze.
W odpowiednich punktach czasowych monitorowania różnicowania należy zebrać komórki z dwóch do trzech dołków na punkt czasowy bez naruszania komórek w innych dołkach i wybarwić zebrane komórki przeciwciałami anty-CD41 i anty-CD42a w celu określenia procentu dojrzałych megakariocytów w kulturach.
W celu mikroskopowej wizualizacji markerów powierzchni komórek, umyj zebrane komórki w 1 mililitrze buforu separacyjnego i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu. Użyj cytospiny, aby zasiać komórki na szklanym szkiełku i przymocuj komórki do szkiełka za pomocą 30-sekundowego zanurzenia w metanolu. Po wysuszeniu na powietrzu oznacz komórki 20 mikrolitrami pożywki montażowej uzupełnionej DAPI i przykryj komórki szkiełkiem nakrywkowym w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Aby policzyć propłytki, należy zebrać komórki w 8 lub 9 dniu różnicowania i wysiać zebrane komórki w 1 x 104 komórki na 200 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy uzupełnionej rekombinowaną ludzką trombopoetyną na dołek w 48-dołkowej płytce. Po 5 dniach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla policz liczbę megakariocytów zawierających propłytki w studzience pod mikroskopem światła odwróconego, używając obiektywu 10 lub 20 razy.
Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, w 14 lub 15 dniu hodowli delikatnie wymieszaj komórki za pomocą pipety Pasteura i zbierz 100 mikrolitrów komórek. Dodaj 1 mililitr buforu Tyrode'a do komórek i osadź je przez odwirowanie. Zebrać supernatant do odwirowania w celu osadzenia cząstek wielkości płytek krwi i ponownie zawiesić cząstki w 100 mikrolitrach świeżego buforu Tyrode. Następnie oznacz cząstki przeciwciałem anty-PAC-1. Aktywuj je difosforanem adenozyny przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przeanalizuj procent pozytywnych zdarzeń PAC-1 za pomocą cytometrii przepływowej.