Ekspansja ex vivo komórek NK z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Komórki NK to duże ziarniste limfocyty, które eliminują nowotwory i infekcje bakteryjne.

W celu ekspansji komórek NK ex vivo należy pobrać zawiesinę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC, zawierających niejednorodną populację limfocytów, w tym komórki NK. Dodaj napromieniowane komórki karmiące - nieproliferujące komórki limfoblastoidalne - które wyrażają związaną z błoną interleukinę 21, mIL-21, wymaganą do aktywacji i ekspansji komórek NK.

Dodaj kokulturę do specjalistycznej studni hodowlanej z membraną przepuszczającą gaz na dnie, umożliwiającą wymianę gazową. Komórki osiadają i namnażają się przez dłuższy czas bez konieczności pasażowania.

Dodaj interleukinę 2, IL-2 i interleukinę 15, IL-15 - cytokiny do proliferacji komórek NK. Inkubować przez odpowiedni okres w warunkach fizjologicznych.

mIL-21 na komórkach zasilających wiąże się ze specyficznym receptorem heterodimerycznym na komórkach NK. Egzogenne IL-15 i IL-2 wiążą się ze swoimi odpowiednimi receptorami. Wiązanie indukuje różne dalsze szlaki sygnałowe - aktywując ekspresję genów - ograniczając starzenie się komórek i prowadząc do przedłużonej proliferacji komórek NK.

Za pomocą cytometrii przepływowej oceniaj ekspansję komórek NK w regularnych odstępach czasu.

Wykreśl zarejestrowane dane, aby przeanalizować szybkość ekspansji komórek i ich czystość - selektywny wzrost docelowego typu komórek NK. Rozmaita ekspansja w okresie inkubacji wskazuje na trwałą proliferację przy zachowaniu wysokiej czystości.

Przemyć oddzielnie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma komórek 221-mIL-21 przez odwirowanie przy 400 g przez 5 minut 10 mililitrami pożywki R-10.

Po odwirowaniu zachowaj 1 x 10⁶ PBMC do cytometrii przepływowej i wymieszaj 5 x 10⁶ PBMC z 10 x 10⁶ 100 napromieniowanymi promieniami gamma komórkami 221-mIL-21 w specjalnej 6-dołkowej płytce. Dodaj 30 mililitrów pożywki R-10 uzupełnionej ludzką interleukiną-2 i ludzką interleukiną-15 do tej samej 6-dołkowej płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, wymieniając pożywkę co trzy do czterech dni.

Podczas inkubacji zapisuj całkowitą liczbę komórek NK lub PBNK we krwi obwodowej, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co trzy do czterech dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.