Test do identyfikacji wydzielania interferonu gamma w mysich narządach limfatycznych

Interferon-gamma lub IFN-γ, cytokina wydzielana przez limfocyty T i komórki NK lub komórki NK, pośredniczy w odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom.

Aby zbadać produkcję IFN-γ in situ, weźmy mysz przeszczepioną z fluorescencyjnie znakowanymi limfocytami T zmodyfikowanymi do ekspresji receptora rozpoznającego albuminę jaja kurzego - antygen modelowy.

Weź zawiesinę bakterii chorobotwórczych – genetycznie zmodyfikowaną do ekspresji albuminy jaja kurzego – i wstrzyknij ją dożylnie myszy, powodując infekcję ogólnoustrojową. Krążące bakterie docierają do śledziony – wtórnego narządu limfatycznego – który wspomaga usuwanie patogenów, ułatwiając interakcję z komórkami odpornościowymi.

Komórki prezentujące antygen pochłaniają bakterie i wyświetlają antygen. Limfocyty T wiążą się z antygenem za pośrednictwem jego receptora, są aktywowane i wytwarzają IFN-γ.

Komórki makrofagów, zakażone bakteriami, uwalniają mediatory immunologiczne i zwiększają aktywację ligandów na swojej powierzchni. Po interakcji z tymi sygnałami komórki NK ulegają aktywacji i wytwarzają IFN-γ.

Wstrzyknąć wewnątrzkomórkowy inhibitor transportu białek, aby ograniczyć wydzielanie IFN-γ, powodując jego wewnątrzkomórkową akumulację.

Zbierz śledzionę myszy. Napraw tkankę i zamroź ją, aby pomóc w cięciu. Za pomocą kriomikrotomu wygeneruj cienkie skrawki tkanek i umieść je na szkiełkach podstawowych. Dodaj przeciwciała specyficzne dla komórek NK, które wiążą się z markerami powierzchniowymi, oraz przeciwciała specyficzne dla IFN-γ, które barwią wewnątrzkomórkowy IFN-γ. Przeciwciała te są znakowane różnymi fluoroforami.

Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wykryć IFN-γ wewnątrz komórek NK i limfocytów T.

Odrzuć roztwór utrwalający i dodaj 5 mililitrów PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, pod delikatnym mieszaniem. Następnie zastąp PBS 5 mililitrami 30% sacharozy i inkubuj przez 12 do 24 godzin, aby utrzymać morfologię tkanki. Teraz organy zapadają się na dnie płyty.

Aby zamrozić próbkę, umieść suchy lód w dużym pojemniku i umieść w nim mniejszy pojemnik zawierający około 50 mililitrów czystego metanolu i kilka kawałków suchego lodu. Delikatnie osusz śledzionę na niestrzępiącej się chusteczce. Wlej kroplę związku OCT na dno formy bazowej i umieść śledzionę w formie. Uważaj, aby nie wytworzyć żadnych bąbelków.

Dodaj około 1 mililitra OCT na śledzionę. Za pomocą kleszczy umieść formę bazową na powierzchni metanolu w kąpieli suchego lodu, upewniając się, że metanol nie dotyka OCT. OCT zgęstnieje i stanie się biały po zamrożeniu. Pamiętaj, aby zamrozić tkankę tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować artefakty.

Na kriomikrotomie ustawionym na temperaturę minus 21 stopni Celsjusza. Przekrój tkankę do pożądanej grubości około 10 mikrometrów. Użyj pędzla, aby zebrać skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych i sprawdzić wizualnie. Pozwól, aby sekcje osiągnęły temperaturę pokojową.

Narysuj okrąg za pomocą blokera cieczy, na przykład pisaka PAP, wokół sekcji tkanki na zewnątrz OCT. Po wyschnięciu tkanki należy ponownie nawodnić próbkę, wlewając 100 mikrolitrów PBS na sekcję tkanki przez 5 minut. Następnie usunąć PBS z sekcji przez aspirację i dodać 100 mikrolitrów roztworu blokującego na sekcję próbki. Inkubować w przykrytej mokrej komorze przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Aby wybarwić przeciwciałami pierwszorzędowymi, zastąp roztwór blokujący przygotowaną mieszanką przeciwciał pierwszorzędowych dla każdej próbki. Inkubować przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza w przykrytej mokrej komorze, przed umyciem zgodnie z manuskryptem.

Teraz rozcieńczyć interesujące nas przeciwciała drugorzędowe do optymalnego stężenia, zwykle 2,5 mikrograma na mililitr w roztworze blokującym. Usunąć końcowy roztwór płuczący z sekcji i dodać przygotowaną mieszaninę przeciwciał wtórnych na wierzch sekcji i inkubować przez jedną do czterech godzin w temperaturze pokojowej w przykrytej, mokrej komorze.

Po umyciu buforem do płukania zgodnie z manuskryptem usunąć roztwór płuczący i przeprowadzić końcowe płukanie PBS. Zassać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i pozwolić, aby pozostały PBS odparował bez całkowitego wyschnięcia sekcji.

Narysuj okrąg wokół sekcji z tyłu slajdu. Następnie umieść kroplę podłoża montażowego na wierzchu próbki, upewniając się, że podłoże pokrywa całą sekcję, i ostrożnie umieść na wierzchu szklankę nakrywkową. Pozwól próbkom polimeryzować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności.

Rano umieść szkiełko pod odwróconym spektralnym mikroskopem skaningowym ze skaningiem spektralnym. Dostosuj obiektywy do 10x/NA 0,40 lub 60x/NA 1,4 do analizy lokalizacji subkomórkowej cytokin.