JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:25 min • July 8th, 2025
Kanaliki nasienne jąder zawierają komórki Sertoliego, które odżywiają komórki rozrodcze. Komórki Sertoliego są połączone ścisłymi połączeniami i są mocno przymocowane do bogatej w kwas hialuronowy macierzy podstawnej. Takie ułożenie komórek Sertoliego reguluje wnikanie komórek odpornościowych do kanalików i chroni rozwijające się komórki rozrodcze przed degradacją.
Aby wyizolować komórki Sertoliego, zacznij od probówki zawierającej częściowo strawione kanaliki nasienne pochodzące z jąder myszy. Kanaliki te nie mają komórek okołokanalikowatych - komórek mięśni gładkich otaczających kanaliki nasienne.
Potraktuj kanaliki koktajlem enzymatycznym zawierającym hialuronidazę - niezbędną do hydrolizy kwasu hialuronowego - i DNazę.
Hialuronidazy dostają się do kanalików i rozszczepiają kwas hialuronowy - polisacharyd podstawowy - inicjując oderwanie komórek Sertoliego od macierzy podstawnej i uwalniając komórki rozrodcze do roztworu. DNaza trawi wszelkie zanieczyszczenia DNA z roztworu, zapobiegając agregacji komórek.
Przemyć trawione enzymatycznie kanaliki buforem, usuwając resztki enzymów, fragmenty komórkowe i komórki rozrodcze. Zawiesić strawione kanaliki i załadować zawiesinę do zestawu igła i strzykawka.
Przepuszczaj roztwór wielokrotnie, aby wytworzyć hydrodynamiczne ścinanie i zakłócić ścisłe połączenia komórek Sertoliego, uwalniając je jako pojedyncze komórki wraz z pozostałościami komórek rozrodczych.
Przefiltruj zawiesinę komórkową, usuwając zanieczyszczenia komórkowe i uzyskując zawiesinę jednokomórkową. Odwirować filtrat w celu granulacji komórek.
Ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej bez surowicy w celu selektywnej ekspansji komórek Sertoliego.
Aby wyizolować komórki Sertoliego, użyj nowej 25-mililitrowej pipety, aby dokładnie zawiesić osadzone kanaliki w 25 mililitrach PBS. Po pozostawieniu kanalików na kolejne 12 minut, użyj tej samej pipety, aby umyć kanaliki jeszcze trzy razy w ten sam sposób. Następnie przenieś kanaliki do nowej 100-mililitrowej butelki z zakrętką i dodaj roztwór hialuronidazy-DNazy-I. Następnie trawić kanaliki w roztrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Sprawdź podwielokrotność zawiesiny za pomocą mikroskopu świetlnego przy 100-krotnym powiększeniu. Krótkie kanaliki, agregaty rurkowe i uwolnione komórki powinny być widoczne. Pozwól agregatom rurowym osiąść przez 10 minut. Następnie użyj nowej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby usunąć supernatant i przemyć kruszywa cztery razy w 25 ml PBS, z 10-minutową sedymentacją między każdym myciem.
Populacja zakażającego PTC zostanie zmniejszona. Po ostatnim praniu dodaj 20 ml pożywki RPMI 1640 do komórek i przepuść zawiesinę przez igłę 18G zamontowaną na 20-mililitrowej strzykawce 10 razy. Następnie szybko potwierdź, że wszystkie agregaty zostały zdysocjowane i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby uzyskać czystą zawiesinę jednokomórkową.
Odwirować filtrat, używając pipety o pojemności 25 mililitrów, aby ostrożnie zassać supernatant. Następnie ponownie zawieś wyizolowane komórki Sertoliego w 40 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy. Następnie policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie trypan-niebieski i dostosuj stężenie komórek do 3 x 106 komórek na mililitr. Na koniec podaj 1 mililitr komórek na studzienkę na płytce sześciodołkowej.