Selektywna izolacja limfocytów T CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Limfocyty T γδ wyrażają receptory limfocytów T, TCR, składające się z łańcuchów gamma i delta o domenach zmiennych i stałych.

Limfocyty T CD4 + Vδ1 - subpopulacja limfocytów T γδ - wykazują współekspresję zmiennego łańcucha Vδ1 i koreceptora CD4. Komórki te migrują do tkanek objętych stanem zapalnym i różnicują się w funkcjonalnie dojrzałe limfocyty T αβ CD4 + lub CD8 + - pośrednicząc w odpowiedzi immunologicznej.

Aby wyizolować limfocyty T CD4 + Vδ1 + z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC, ponownie zawieś komórki w buforze. Użyj odczynnika blokującego Fc, aby zablokować receptory Fc na powierzchni komórki i zapobiec wiązaniu niespecyficznych przeciwciał.

Dodać przeciwciała anty-Vδ1 sprzężone z fluoroforem FITC, które wiążą się z antygenami Vδ1 komórek T γδ. Inkubować z mikrokulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałami anty-FITC, które przyłączają się do barwnika FITC na przeciwciałach związanych z komórkami T Vδ1.

Przepuścić mieszaninę przez kolumnę magnetyczną, aby przyciągnąć komórki T Vδ1+ związane z kulkami; limfocyty T Vδ1-T pozostają niezwiązane, a następnie są wypłukiwane. Na siłę przepłukać kolumnę, przepychając przez nią bufor, aby odłączyć limfocyty T Vδ1+.

Inkubuj komórki za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem anty-CD4, które wiążą się z koreceptorem CD4 komórek. Umieść rurkę w magnesie, aby przyciągnąć komórki T CD4 + Vδ1 + związane z koralikami; limfocyty T CD4-Vδ1+ pozostają niezwiązane.

Ponownie zawiesić limfocyty T CD4 + Vδ1 + w pożywce. Dodaj odczynnik odłączający kulki, aby uwolnić kulki z komórek. Załóż rurkę na magnes, aby oddzielić koraliki.

Zebrać supernatant komórek CD4+ Vδ1+ do dalszej analizy.

Przed rozpoczęciem izolacji limfocytów T Vδ1 należy użyć podwielokrotności 1 x 10⁶ PBMC, aby ocenić częstość występowania komórek T Vδ1CD4-dodatnich w próbce dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie odwiruj resztę limfocytów i ponownie zawieś osad w 60 mikrolitrach buforu MACS na 1 x 10⁷ komórek.

Następnie zablokuj komórki w 20 mikrolitrach odczynnika blokującego Fc na 1 x 10⁷ komórek, a następnie dodaj 10 mikrolitrów sprzężonego z FITC przeciwciała anty-ludzkiego Vδ1 na 1 x 10⁷ komórek przez 12 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności. Pod koniec inkubacji umyj komórki w 14 mililitrach buforu MACS.

Zawiesić osad w 80 mikrolitrach buforu MACS na 1 x 10⁷ komórek i dodać 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-FITC na 1 x 10⁷ komórek z mieszaniem. Po 15 minutach w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza umyj komórki w 10 mililitrach świeżego buforu MACS.

Podczas wirowania należy zrównoważyć wstępnie schłodzoną kolumnę magnetyczną z 500 mikrolitrami buforu MACS. Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach buforu MACS i ostrożnie dodaj je do górnej części kolumny.

Przepłukać kolumnę trzema 500-mikrolitrowymi płukankami buforowymi MACS. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i użyj tłoka, aby szybko przepłukać komórki Vδ1-dodatnie 1 mililitrem buforu MACS do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Po przepuszczeniu komórek przez drugą kolumnę, wiruj 25 mikrolitrów kulek CD4 przez 30 sekund. Następnie przenieś kulki do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej, zawierającej 1 mililitr buforu MACS i umieść probówkę na magnesie.

Po 1 minucie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby ostrożnie zassać supernatant i ponownie zawieś kulki w 25 mikrolitrach buforu MACS. Następnie odwiruj izolowane komórki Vδ1-dodatnie i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu MACS. Energicznie wymieszaj komórki z koralikami. Następnie, po 20 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza, przy ciągłym przechylaniu, umieść rurkę z powrotem na magnesie.

Aby uniknąć utraty objętości próbki i zminimalizować obecność zanieczyszczających komórek CD4-ujemnych, konieczne jest odpipetowanie pozostałego buforu z wnętrza wieczka z powrotem do fiolki.

Po dwóch minutach za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś CD4-ujemny Vδ1-dodatni supernatant zawierający komórki do świeżej probówki. Następnie usuń komórki CD4-dodatnie z magnesu i zawieś je ponownie w 500 mikrolitrach buforu MACS.

Po dwukrotnym usunięciu komórek CD4-ujemnych, jak właśnie pokazano, inkubować komórki CD4-dodatnie w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej i 10 mikrolitrach roztworu odrywającego kulki w temperaturze pokojowej przez 45 minut przy ciągłym przechylaniu. Pod koniec inkubacji należy umieścić komórki z powrotem w magnesie na 1 minutę i za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieść bezperełkowy supernatant Vδ1-dodatni CD4-dodatni zawierający komórki do nowej probówki.

Po usunięciu pozostałych koralików jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano, odkręć komórki. Następnie ponownie zawieś Vδ1-dodatnie komórki CD4-dodatnie w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu w celu zliczenia.