Izolacja sieci komórek odpornościowych dziąseł z bloków zębów myszy

Dziąsło, czyli tkanka dziąseł, otacza szyjną część zębów i kość szczęki.

Tkanka dziąseł składa się z warstwy nabłonka, oddzielonej od leżącej poniżej tkanki łącznej błoną podstawną bogatą w kolagen IV. Dziąsłowa tkanka łączna zawiera sieć komórek odpornościowych, w tym limfocyty, komórki tuczne i neutrofile, które chronią dziąsło przed infekcjami.

Aby wyizolować sieć komórek odpornościowych dziąseł, weź bloki zębów myszy zawierające mocno przyczepioną tkankę dziąseł. Potraktuj bloki koktajlem enzymatycznym - zawierającym kolagenazy typu czwartego i DNazy.

Kolagenazy wnikają do tkanki, degradują kolagen-IV i naruszają błonę podstawną oraz nabłonek dziąseł, powodując poluzowanie dziąseł z zębów. Tymczasem DNazy degradują zanieczyszczenia DNA. Dodaj środek chelatujący do probówki; w celu usunięcia kationów dwuwartościowych i zapobieżenia agregacji komórek.

Przenieś strawione bloki zębów na szalkę Petriego zawierającą pożywkę DNazy. Usuń tkankę dziąsła z bloków zębów i przenieś ją do sitka komórkowego.

Za pomocą tłoka rozgnieć chusteczkę. Ta mechaniczna dysocjacja przerywa dziąsłową warstwę łączną, uwalniając komórki odpornościowe z tkanki. Umyć sitko pożywką i zebrać uwolnione komórki w filtracie.

Odwirować filtrat, granulując komórki, i wyrzucić supernatant zawierający resztki enzymów i zanieczyszczeń. Ponownie zawiesić populację komórek przenoszących komórki odpornościowe w kompletnym pożywce, gotowym do przyszłej analizy.

Wyeliminuj nadmiar tkanki z granicy dziąsła i przenieś bloki szczęki i żuchwy do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 5 mililitrów kolagenazy i DNazy na lodzie. Trawić tkankę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę, dodając 50 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA w ciągu ostatnich pięciu minut. Następnie dodaj 5 mililitrów zimnej pożywki DNazy do tkanek i delikatnie wymieszaj zawartość probówki, mieszając. Następnie przenieś cztery bloki tkanki na szalkę Petriego i przykryj je 500 mikrolitrami świeżej pożywki DNazy.

Użyj skalpela, aby usunąć dziąsło z każdego bloku tkanki i przenieś całą zawartość naczynia do sitka do komórek o średnicy 70 mikronów na 50-mililitrowej probówce. Umyj szalkę Petriego i sitko 3 do 5 mililitrami świeżej pożywki DNazy, a następnie użyj tłoka sterylnej 3-mililitrowej strzykawki, aby zetrzeć tkankę dziąsła z siatką sitka. Przepłukać sitko 30 do 35 mililitrami zimnego podłoża DNazy i odwirować filtrat. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża i określ liczbę żywotnych komórek.