Wizualizacja śródnabłonkowych limfocytów śródnabłonkowych gamma delta

Śródnabłonkowe limfocyty gamma delta, γδ IELs, są wyspecjalizowanymi migrującymi limfocytami T wykazującymi ekspresję receptorów limfocytów T gamma delta. Komórki te znajdują się głównie w nabłonku jelitowym i patrolują nabłonek, aby ograniczyć translokację patogenów przez jelito.

Aby uwidocznić γδ IELs w żywym organizmie, zacznij od znieczulonej myszy transgenicznej z częściowo odsłoniętym jelitem cienkim. Transgeniczna mysz jest genetycznie modyfikowana w celu ekspresji białek reporterowych – wzmocnionych białek zielonej fluorescencji – wyłącznie w γδ IELs, co umożliwia ich śledzenie.

Za pomocą elektrokoagulacji utwórz linię perforacji nad odsłoniętym jelitem cienkim wzdłuż powierzchni antykrezki, zapobiegając nadmiernemu krwawieniu.

Wykonaj podłużne nacięcie nad linią perforacji, aby odsłonić błonę śluzową jelita, pokazując wiele wypustek przypominających palce — kosmki. Każdy kosmek zawiera komórki nabłonkowe z rezydującymi γδ IEL, które wystają do światła jelita.

Ustaw mysz tak, aby odsłonięta powierzchnia błony śluzowej miała bezpośredni kontakt z barwnikiem fluorescencyjnym, nadając światło czerwonej fluorescencji.

Wyobraź sobie mysz pod mikroskopem konfokalnym. Zlokalizuj kosmek i obraz w różnych płaszczyznach ogniskowych wzdłuż osi z, zaczynając od nabłonka końcówki biopsu. Połącz te sekcje optyczne, aby uzyskać obraz 3D.

Obrazowanie przyżyciowe pokazuje dynamiczny ruch IEL γδ zielonej fluorescencji wzdłuż błony podstawnej komórki nabłonka w pobliżu czerwonego światła.

Umieszczając dwie pary kleszczy po obu stronach leżącej poniżej krezki między naczyniami krwionośnymi, delikatnie pocieraj końcówki kleszczy o siebie, aby utworzyć otwór w błonie. Za pomocą kątowych kleszczy i zakrzywionej, stożkowej igły przymocowanej do 5-centymetrowego szwu, przeniknij jedną stronę otrzewnej przez otwór w błonie i w górę przez drugą stronę wyściółki otrzewnej, umieszczając jeden szew u górze, a drugi w pobliżu dołu nacięcia, aby zamknąć nacięcie, utrzymując pętlę jelita na zewnątrz.

Aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu, nie wiąż ani nie rozrywaj żadnych naczyń krwionośnych podczas umieszczania struktury brzusznej i ogranicz wszelkie zewnętrzne obchodzenie się z jelitem.

Następnie w ten sam sposób zamknij skórę pod pętlą jelitową, umieszczając jeden szew w środku nacięcia między poprzednimi szwami w leżącej poniżej otrzewnej. Za pomocą elektrokoagulacji wykonaj linię perforacji wzdłuż granicy przeciwkrezkowej i natychmiast nałóż kilka kropel wody na powierzchnię jelita, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu tkanek wywołanemu ciepłem.

Osusz chusteczką Kimwiste, aby usunąć resztki wody. Użyj nożyczek Vannas, aby wyciąć około 1,5-centymetrową poziomą szczelinę na dystalnej krawędzi kauteryzowanej tkanki, wzdłuż długości kauteryzowanej linii w kierunku bliższego końca eksternalizowanego segmentu tkanki. Kiedy powierzchnia błony śluzowej zostanie odsłonięta, przykryj brzuch wilgotnym Kimwiste, aby utrzymać nawilżenie tkanki.

W przypadku obrazowania mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem należy przetransportować mysz do mikroskopu w zakrytym naczyniu. Uruchom oprogramowanie do obrazowania, odchyl głowicę mikroskopu do tyłu i dodaj 150 mikrolitrów 1 mikromolowego barwnika AlexaFluor w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka na szklane dno. Ustaw mysz tak, aby otwarta powierzchnia błony śluzowej bezpośrednio stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym.

Umieść mysz i szalkę na stoliku do obrazowania we wstępnie ogrzanym inkubatorze. Ustaw intensywność wzbudzenia i czas ekspozycji dla każdego lasera na nie więcej niż odpowiednio 10 do 15 miliwatów i 120 do 150 milisekund i dostosuj średnią klatek na "2".

Włącz funkcję wzmocnienia zwielokrotniającego elektrony, aby zredukować szum tła, i wybierz kalibrację obiektywu 63X, aby zapewnić prawidłowy pomiar rozmiaru piksela. Korzystając z lasera 405 nm i obiektywu pneumatycznego 20x, ręcznie wizualizuj jądra, aby zlokalizować pole kosmków, które nie mają zauważalnego ruchu lub dryfu, unikając obszarów sztucznego ruchu spowodowanego oddychaniem, perystaltyką lub biciem serca.

Korzystając ze skanu XY, zapisz współrzędną x-y pola zainteresowania i przełącz się na obiektyw 63X z zanurzeniem w glicerolu. Uzyskaj obraz na żywo w kanale 405 nanometrów przez maksymalnie 1 minutę, aby potwierdzić, że kosmki w wybranym polu są stabilne, jednocześnie dostosowując ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ortogonalną tuż pod końcówką kosmka.

Następnie należy uzyskać stosy Z, zaczynając tuż pod nabłonkiem końcówki kosmków, około 15 do 20 mikrometrów, w dół do kosmków, aż trudno będzie rozdzielić jądra w krokach co 1,5 mikrometra. 3 do 5 minut po rozpoczęciu akwizycji potwierdź stabilność obrazu i ruchliwość śródnabłonkowych komórek gamma-delta i kontynuuj pozyskiwanie obrazów przez 30 do 60 minut dla każdego pola kosmków.