Izolacja mikrocząstek pochodzących z apoptotycznych limfocytów T in vitro

Mikrocząstki komórkowe to submikronowe pęcherzyki związane z błoną, które otaczają biomolekuły uwolnione z błony plazmatycznej komórek eukariotycznych ulegających apoptozie.

Aby wytworzyć mikrocząstki pochodzące z limfocytów T, LMP in vitro, należy pobrać kolbę hodowlaną zawierającą hodowlę limfocytów T. Dodaj aktynomycynę-D, antybiotyk. Inkubować przez odpowiedni czas.

Aktynomycyna-D dostaje się do limfocytów i przemieszcza się do jądra. Interkaluje między określonymi parami zasad DNA, hamując transkrypcję. Prowadzi to do zatrzymania cyklu komórkowego i aktywuje szlak apoptozy.

Na początku apoptozy aktywowana kaspaza-3 rozszczepia się i aktywuje kinazę związaną z rho, ROCK1. Z kolei ROCK1 fosforyluje swoje dalsze białka docelowe, powodując skurcz aktomiozyny, co prowadzi do pęcherzenia błony, a następnie uwalniania LMP zawierających składniki cytozolowe i jądrowe do pożywki.

Komórki w końcu ulegają apoptozie.

Po inkubacji przenieś pożywkę hodowlaną do świeżej probówki. Wirówka do osadzania limfocytów T. Przenieść supernatant do świeżej probówki.

Wirować w celu usunięcia dużych resztek komórek. Przenieść supernatant zawierający LMP do butelki. Wykonaj ultrawirowanie z dużą prędkością, aby zagnieździć LMP. Ponownie zawieś LMP w buforze. Przechowywać w niskich temperaturach do czasu dalszej analizy.

Na początek hoduj limfocyty T CEM w czterech kolbach T175, z których każda zawiera 150 mililitrów świeżej pożywki, i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do gęstości 2 milionów komórek na mililitr.

Zebrać komórki z każdej kolby przez odwirowanie w ilości 200 razy g przez 5 minut i ponownie zawiesić 300 razy 10 do 6 komórek w nowej kolbie T175 zawierającej 150 mililitrów świeżej pożywki, aby utrzymać gęstość 2 milionów komórek na mililitr. Dodaj 37,5 mikrolitra aktynomycyny D do pożywki o końcowym stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Przenieś całą pożywkę hodowlaną do 50-mililitrowych stożkowych probówek i wiruj komórki z prędkością 750 razy g przez 5 minut. Następnie przenieś supernatant do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj przy 1,500 razy g przez 15 minut, aby usunąć duże fragmenty komórek.

Następnie przenieś supernatant do 250-mililitrowej butelki i ultrawiruj pod ciśnieniem 12 000 razy g przez 50 minut. Następnie wyrzuć supernatant i zbierz granulki. Użyj 40 mililitrów sterylnego PBS do umycia granulek wzbogaconych w LMP w 50-mililitrowej probówce i odwiruj pod ciśnieniem 12 000 g przez 50 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie.

Zebrać supernatant z ostatniego prania, który ma być użyty jako kontrola pojazdu, z 1 mililitrem PBS. Zawiesić granulki i przenieść do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Podziel i przechowuj izolowane LMP w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.