Znakowanie mysich limfocytów T Helper za pomocą znakowanych radioaktywnie przeciwciał monoklonalnych
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:28 min • July 8th, 2025
Aby znakować radioizotopowo mysi pomocnik T, limfocyty Th przenoszące receptor limfocytów T, TCR, specyficzny dla peptydu albuminy jaja kurzego, pobierają probówkę zawierającą znakowane radioaktywnie przeciwciała monoklonalne, mAb, o pożądanej aktywności radioaktywnej.
MAb zawiera mysi mAb specyficzny dla TCR wyrażony na błonie mysich limfocytów Th. Chelator sprzęga mAb i izotop miedzi emitujący pozytony, tworząc stabilny kompleks.
Rozcieńczyć znakowane radioaktywnie przeciwciała monoklonowe solą fizjologiczną. Następnie dodać rozcieńczone radioizotopowane mAb do wielodołkowej płytki zawierającej zawiesinę limfocytów Th. Krótko inkubować.
W hodowli znakowane radioaktywnie mAb wiążą się z TCR na błonach limfocytów Th. Po inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do świeżej probówki.
wirówka. Odrzucić supernatant zawierający niezwiązane przeciwciała znakowane radioizotopem. Zawiesić limfocyty Th w pożywce i przenieść do płytki wielodołkowej. Inkubuj przez dłuższy czas.
Znakowane radioaktywnie wiązanie mAb-TCR powoduje rekrutację białka adaptorowego do cytoplazmatycznej strony błony plazmatycznej, z którą wiążą się triskeliony klatryny i tworzą dół pokryty klatryną.
Białka pomocnicze pomagają uszczypnąć pęcherzyk z błony plazmatycznej, ułatwiając internalizację znakowanego radioaktywnie kompleksu mAb-TCR do cytoplazmy. Ostatecznie TCR ulegają reekspresji na błonach limfocytów Th.
Znakowane radioizotopowo limfocyty Th są gotowe do dalszych eksperymentów.
W przypadku znakowania radiokomórkowego TH1 specyficznych dla albuminy kurzej komórek jaja kurzego, należy najpierw użyć kalibratora dawki, aby pobrać 37 megabekereli interesującego nas przeciwciała radioaktywnego specyficznego dla limfocytów T do strzykawki bez martwej objętości.
Następnie dozuj przeciwciało do kubka reakcyjnego i zmierz i odejmij pozostałą ilość reaktywności w strzykawce od pobranej ilości. Następnie dodaj jeden mililitr soli fizjologicznej do kubka, aby uzyskać roztwór 37 megabekereli na mililitr.
Następnie dodaj dwa razy 10 do szóstej komórki OVA-TH1 w 0,5 ml kompletnej pożywki do każdego dołka 48-dołkowej płytki, a następnie 20 mikrolitrów znakowanego radioaktywnie roztworu przeciwciała. Po 30 minutach w bezpiecznym dla promieniowania inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 7,5% dwutlenku węgla, połącz znakowane radioaktywnie komórki w 50-mililitrowej stożkowej probówce na dwa płukania w 10 mililitrach PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania radioizotopowego mysich limfocytów T pomocniczych wykazujących ekspresję receptora limfocytów T swoistego dla peptydu owalbuminy kurzej. Proces ten polega na wykorzystaniu znakowanych radioaktywnie przeciwciał monoklonalnych w celu ułatwienia internalizacji kompleksu TCR do cytoplazmy limfocytów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Limfocyty T pomocnicze odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi odpornościowej.
- Techniki znakowania radioizotopowego są niezbędne do śledzenia i badania interakcji komórkowych.
- Zrozumienie dynamiki TCR może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji odpornościowej.
- Kurza owalbumina jest antygenem modelowym stosowanym w badaniach immunologicznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody znakowania radiologicznego limfocytów pomocniczych T.
- Zbadanie procesu internalizacji receptorów TCR po związaniu z przeciwciałami znakowanymi radiologicznie.
- Przygotowanie znakowanych radiologicznie limfocytów Th do dalszych zastosowań eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie znakowanych izotopowo przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla TCRs.
- Inkubacja limfocytów Th z przeciwciałami znakowanymi izotopowo.
- Wirowanie w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
- Resuspensja komórek do dalszych eksperymentów.
Główne wyniki
- Skuteczne wiązanie znakowanych izotopowo przeciwciał monoklonalnych (mAbs) z receptorami TCR na limfocytach Th.
- Internalizacja kompleksu mAb-TCR do cytoplazmy.
- Ponowna ekspresja receptorów TCR na błonach limfocytów po internalizacji.
- Przygotowanie znakowanych izotopowo limfocytów Th do dalszych badań.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na skuteczne znakowanie limfocytów Th w celu ich śledzenia i analizy.
- Wnioski z niniejszego badania mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia dynamiki limfocytów T.
- Technikę tę można zastosować w różnych kontekstach badań immunologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Radiomarkowanie limfocytów T pomocniczych myszy za pomocą przeciwciał monoklonalnych umożliwia precyzyjne, nieinwazyjne śledzenie migracji komórek odpornościowych przy użyciu obrazowania PET/CT. Możliwość ta wspiera wczesną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na immunologię. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do strategii modulacji odpornościowej i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych w badaniach nad immuno-onkologią i chorobami autoimmunologicznymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację migracji limfocytów T specyficznych dla antygenu in vivo w celu weryfikacji hipotez.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów immunologicznych poprzez monitorowanie zaangażowania i internalizacji TCR.
- Ułatwia mitygację ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie odpowiedzi komórkowej na wiązanie przeciwciał.
- Zwiększa pewność prognostyczną strategii modulacji szlaków odpornościowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania znakowanych promieniotwórczo komórek odpornościowych do dalszych analiz.
- Gwarantuje powtarzalność i ilościową ocenę oddziaływań przeciwciało-komórka.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych populacji komórek dla platform przesiewowych opartych na obrazowaniu.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na migrację komórek odpornościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników obrazowania przedklinicznego do dynamiki komórek odpornościowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od walidacji in vitro do śledzenia in vivo w modelach zwierzęcych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów terapeutycznych celujących w układ odpornościowy.
- Dostarcza translacyjnych danych o biomarkerach w zakresie lokalizacji i przeżywalności komórek odpornościowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda znakowania radioizotopowego wpisuje się w ciąg procesów od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i translacyjne procesy obrazowania.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących celowania i ruchu receptorów limfocytów T.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe znakowanie komórek do analiz obrazowych.
- Analityka: Dostarcza odczyty PET/CT do porównywania rozkładu komórek odpornościowych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy walidację in vitro ze śledzeniem komórek odpornościowych in vivo w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do radioznakowania różnych populacji komórek odpornościowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad celowaniem i ruchem komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy znakowania radioizotopowego i obrazowania w analizie komórek odpornościowych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad terapeutykami immunomodulującymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów z zakresu immunologii i immunoonkologii z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu radiochemii oraz doświadczenie w pracy z komórkami układu odpornościowego.
- Konieczny jest dostęp do obrazowania PET/CT oraz infrastruktury do kalibracji dawek.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności znakowania komórek i obrazowania.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody dla różnych typów komórek odpornościowych lub celów receptorowych.
- Niezbędne jest przestrzeganie protokołów bezpieczeństwa radiologicznego oraz zgodność z przepisami regulacyjnymi.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
![Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55537.jpg%3Fv%3D2026-08-27T11%253A03%253A10.000Z&w=384&q=75)
Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i aktywacja mysich limfocytów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026