Technika in vitro do różnicowania komórek T pomocniczych wytwarzających GM-CSF od naiwnych limfocytów T

Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, GM-CSF, jest wydzielany przez pomocnika T wytwarzającego GM-CSF lub komórki T_HGM. Komórki te wykazują niską ekspresję innych cytokin specyficznych dla limfocytów T pomocniczych.

Aby rozpocząć różnicowanie in vitro komórek T_HGM, należy wziąć zawiesinę limfocytów T pomocniczych - wyizolowaną ze śledziony myszy - zawierającą dojrzałe komórki aktywowane antygenem i niezróżnicowane komórki naiwne.

Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała skierowane do charakterystycznych markerów powierzchniowych naiwnych i dojrzałych komórek. Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby wyizolować naiwne limfocyty T.

Umieść komórki w dołku pokrytym przeciwciałami, które wiążą się z kompleksem receptora limfocytów T. Dodaj przeciwciało, które wiąże się z receptorem kostymulującym. Synergiczne wiązanie aktywuje komórki.

Dodaj interleukinę 7 - cytokinę - indukując różnicowanie w komórkach_{T G}GM i produkcję GM-CSF. Dodaj octan mirystynianu forbolu, PMA - związek prozapalny, jonomycynę - jonofor wapnia i inhibitor transportu białek.

PMA dostaje się do komórki i aktywuje kinazę białkową. Przepuszczalna przez błonę jonomycyna przemieszcza jony wapnia wewnątrz komórki, zwiększając wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia.

Aktywacja kinazy białkowej i wysoki poziom wapnia inicjują sygnały, które restymulują komórki T_HGM - co skutkuje wyższą produkcją GM-CSF. Inhibitor transportu białek blokuje wydzielanie GM-CSF, wspomagając wykrywanie wewnątrzkomórkowe.

Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne, wykrywając cytokiny wewnątrzkomórkowe i analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Większość komórek wykazujących wysoki poziom GM-CSF, ale niską ekspresję innych cytokin, wskazuje na pomyślne różnicowanie się w komórki T_HGM.

Aby wyizolować limfocyty T CD4-dodatnie, ponownie zawieś osad białych krwinek w 5 mililitrach bufora do izolacji komórek i przefiltruj zawiesinę komórek przez 30-mikrometrowe sitko do nowej 15-mililitrowej probówki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Po zliczeniu ponownie zawiesić komórki w stężeniu buforowym 1 x 10⁷ na 90 mikrolitrów i dodać 10 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD4 na 1 x 10⁷ komórek na 15-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza, z mieszaniem co 5 minut.

Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym i wstępnie zwilż kolumnę 2 mililitrami buforu. Następnie przemyć komórki 5 mililitrami buforu i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu. Załaduj próbkę do kolumny i zbierz frakcję CD4-ujemną w 15-mililitrowej stożkowej probówce.

Gdy wszystkie komórki przejdą przez kolumnę, przemyj zbiornik trzy razy 1 mililitrem buforu na pranie, zanim wyschnie. Po ostatnim praniu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej stożkowej rurki i zanurz kolumnę w 2 mililitrach buforu do izolacji komórek, aby usunąć dodatnią frakcję kulkową. Następnie zbierz komórki CD4-dodatnie przez odwirowanie.

W celu aktywowanego fluorescencją sortowania komórek naiwnych limfocytów T, ponownie zawieś posortowaną kulkami osadkę komórek CD4-dodatnich w 500 mikrolitrach buforu i wymieszaj komórki z odpowiednim koktajlem przeciwciał sprzężonych z fluorescencją. Po 20 do 30 minutach na lodzie, chronionym przed światłem, umyj komórki w 5 mililitrach świeżego buforu i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu.

Przefiltruj komórki przez nylonową siatkę i przenieś komórki do probówki FACS wstępnie zakodowanej 500 mikrolitrami buforu. Bramka do wyboru CD4-dodatnich, CD25-ujemnych i CD44 niskich ligów CD62 i wysokich populacji komórek. Następnie posortuj naiwne frakcje komórek T CD4-dodatnich, CD25-ujemnych, CD-44 o niskim poziomie ligu CD-62 i wysokiej zawartości limfocytów T do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i osadzaj izolowane naiwne limfocyty T CD4-dodatnie przez wirowanie.

W przypadku czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów lub GM-CSF, różnicowania komórek pomocniczych T, ponownie zawieś posortowane limfocyty T w stężeniu 1 x 10⁶ komórek na mililitr w kompletnej pożywce RPMI zawierającej 50 mikromolowy beta-merkaptoetanol i odessaj przeciwciało anty-CD3 epsilon z każdej studzienki wstępnie zakodowanej 48-dołkowej płytki.

Następnie zasiaj 2,5 x 10⁵ komórek do każdej studzienki wraz z IL-7, anty-CD28 i anty-IFN gamma i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO₂ przez trzy dni. W trzecim dniu hodowli użyj mikroskopu, aby sprawdzić różnicowanie komórek i zbierz komórki do odwirowania.

Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce complete RPMI na dwa prania, ponownie zawieszając komórki w 1 mililitrze świeżej kompletnej pożywki po drugim praniu w celu zliczenia. Podziel komórki na trzy równe objętości i ponownie stymuluj pierwszą porcję komórek PMA i jonomycyną w obecności inhibitora transportu białek przez 4 do 6 godzin.

Pod koniec stymulacji zbierz komórki do barwienia przeciwciałem anty-CD4. Po 30 minutach utrwalić komórki 200 mikrolitrami buforu utrwalającego przez 20 do 60 minut, a następnie dwa płukania w 1 mililitrze buforu przepuszczalnego na pranie. Następnie barwić pod kątem ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych przez 30 minut w ciemności.