JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:29 min • July 8th, 2025
Aby monitorować rekrutację neutrofili - niezbędnych komórek odpornościowych, które ułatwiają usuwanie bakterii, zacznij od znieczulonej, transgenicznej myszy z obniżoną odpornością z raną odsłaniającą tkankę łączną na grzbiecie.
Neutrofile transgenicznej myszy wyrażają wzmocnione białko zielonej fluorescencji, które ułatwia śledzenie neutrofili. Dodatkowo ich upośledzona zdolność zabijania bakterii sprawia, że mysz jest bardziej podatna na infekcje.
Weźmy genetycznie zmodyfikowany inokulant bakteryjny posiadający właściwości bioluminescencji – emitujące światło.
Wstrzyknij inokulum bakteryjne w zranione miejsce, zapewniając jego dostarczenie między tkanką łączną a powięzią - warstwą tkanki włóknistej pod tkanką łączną. W miejscu wstrzyknięcia bakterie namnażają się i kolonizują, powodując infekcję tkanek.
W odpowiedzi na infekcję komórki odpornościowe uwalniają chemokiny – chemiczne cząsteczki sygnałowe, które przyciągają neutrofile. Neutrofile szybko migrują poprzez chemotaksję – ruch wywołany chemikaliami i wynaczyniają się przez naczynia krwionośne do tkanki w pobliżu infekcji bakteryjnej.
Wyobraź sobie mysz pod kątem sygnałów bioluminescencyjnych i fluorescencyjnych, reprezentujących odpowiednio obciążenie bakteryjne i rekrutowane neutrofile.
Z biegiem czasu wzrost sygnałów bioluminescencyjnych i fluorescencyjnych koreluje ze zwiększonym obciążeniem bakteryjnym i ciągłą rekrutacją neutrofili w miejscu infekcji.
W celu zaszczepienia gronkowcem złocistym napełnij strzykawkę insulinową o rozmiarze 28 50 mikrolitrami przygotowanego bioluminescencyjnego inokulantu bakteryjnego i palcem pociągnij skórę właściwą rannego zwierzęcia na bok. Trzymając strzykawkę prawie równolegle do tkanki, powoli wkładaj strzykawkę do tkanki, aż do momentu wyczucia nagłego spadku oporu, wskazującego na przebicie powięzi.
Z igłą umieszczoną w środku rany, powoli dostarcz całą objętość inokulantu. Upewnij się, że inokulant tworzy pęcherzyk w środku rany z minimalnym wyciekiem lub dyspersją i powoli wyjmij strzykawkę ze zwierzęcia. Następnie należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce z ciepłem i monitorowaniem, aż do pełnego wyzdrowienia.
Po zranieniu i zakażeniu, a także codziennie podczas eksperymentu, umieść znieczuloną mysz w obrazie bioluminescencyjnym i fluorescencyjnym tak, aby rana była jak najbardziej płaska. W oprogramowaniu imagera wybierz Luminescence (Luminescencja) i Photograph (Fotografia) jako tryby obrazowania. Czas ekspozycji powinien być ustawiony na 1 minutę przy małym binningu, F/stop 1 dla luminescencji, F/stop 8 dla zdjęcia i Open dla filtra emisji. Następnie kliknij przycisk Pobierz, aby nagrać obraz.
W przypadku obrazowania fluorescencyjnego in vivo wybierz Fluorescencja i Fotografia jako tryby obrazowania. Czas ekspozycji powinien być ustawiony na 1 sekundę przy małym binningu, F/stop 1 dla fluorescencji, F/stop 8 dla fotografii oraz długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 465 na 30 nanometrach i 520 na 20 nanometrach przy wysokim natężeniu lampy. Następnie kliknij przycisk Pobierz, aby nagrać obraz.
Po uzyskaniu obu zestawów obrazów należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.
W celu analizy obrazu otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i umieść domyślny okrągły obszar zainteresowania na całym obszarze rany, w tym na otaczającej skórze. Kliknij opcję Zmierz obszar zainteresowania i zapisz wartości średniego strumienia dla rany, aby umożliwić wykreślenie średniego strumienia każdego sygnału w funkcji czasu.
Aby zmierzyć gojenie się rany, umieść okrągły obszar zainteresowania na krawędzi rany i zmierz obszar rany w centymetrach do kwadratu, aby umożliwić wykreślenie ułamkowej zmiany w stosunku do linii podstawowej w czasie.