Identyfikacja inhibitorów kinaz, które modulują odpowiedź tymocytów na silne sygnały TCR

Zacznij od komórek tymocytów myszy na płytce wielodołkowej. Dodaj kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Do podzbioru studzienek dodać odpowiednie stężenie inhibitora kinazy testowej. Inkubować.

Przeciwciała wiążą się z receptorami CD3 i CD28 na powierzchni komórki na podwójnie dodatnich tymocytach i aktywują je, powodując regulację w dół receptorów limfocytów T, TCR i aktywację cytozolowej kinazy białkowej.

Te kinazy białkowe aktywują dalsze szlaki sygnałowe, prowadząc do zwiększonej ekspresji CD69 na powierzchni komórki i aktywacji cytozolowej kaspazy-3. Aktywowana kaspaza-3 rozszczepia niezbędne białka komórkowe - inicjując apoptozę tymocytów.

W komórkach leczonych inhibitorem kinazy inhibitory blokują kinazy cytozolowe, modulując ekspresję CD69 i aktywację kaspazy-3.

Pipeta w znakowanym fluoroforem koktajlu przeciwciał, który wiąże się z koreceptorami TCR, CD4 i CD8 oraz receptorami CD69 tymocytów. Potraktuj tymocyty buforem, aby je utrwalić i przepuszczalnić.

Inkubować z przeciwciałem anty-kaspazy-3 znakowanym fluoroforem, które wiąże się z cytozolową kaspazą-3. Analizuj tymocyty za pomocą cytometrii przepływowej.

Podwójnie dodatnie tymocyty kontrolne eksprymują fluorescencyjne markery powierzchniowe komórek CD4, CD8 i CD69 oraz wewnątrzkomórkową kaspazę-3 i wykazują regulację w dół TCR. W przeciwieństwie do tego, tymocyty traktowane inhibitorem wykazują niższy poziom fluorescencyjnego CD69 i kaspazy-3.

Aby rozpocząć leczenie tymocytów inhibitorami kinaz, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 40 mikrolitrów tymocytów na studzienkę do płytki o małej objętości. Połóż talerz na lodzie. Następnie należy odpipetować jedną część inhibitorów kinazy, DMSO i deksametazonu oraz cztery części kompletnej pożywki RPMI na 96-dołkową płytkę.

Oznaczyć osiem studzienek płytki o małej objętości do niepoddanych działaniu substancji kontrolnych, cztery studzienki do kontrol dodatnich poddanych działaniu deksametazonu w celu śmierci komórki, dodając rozcieńczony deksametazon w stężeniu 5 mikromolowym, oraz cztery studzienki do kontrolnych poddanych działaniu nośnika, dodając 0,5 mikrolitra rozcieńczonego DMSO. Następnie, z odpowiednich dołków płytki inhibitora, dodaj 0,5 mikrolitra każdego rozcieńczonego inhibitora do płytki 96-dołkowej.

Aby rozpocząć stymulację tymocytów, najpierw upewnij się, że kulki anty-CD3 i CD28 są równomiernie zawieszone. Następnie umyj 1 mililitr kulek 2 mililitrami buforu PBS. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu i odessać roztwór. Następnie ponownie zawieś kulki w 1 mililitrze całego podłoża RPMI.

Dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę zawiesiny kulek do każdej próbki poddanej działaniu inhibitora, czterech próbek poddanych działaniu DMSO i czterech z 8 próbek niepoddanych działaniu substancji. Dodaj 10 mikrolitrów pełnego RPMI do pozostałych czterech nieuzdatnionych studzienek.

Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę. Następnie inkubuj tymocyty w środowisku o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 17 do 20 godzin lub przez noc.

Zalać automatyczną myjkę płytową z przepływem laminarnym najpierw 150 mililitrami roztworu etanolu-Tween, następnie wodą dejonizowaną uzupełnioną 1% Tween-20, a na końcu buforem płuczącym FACS. Pod koniec inkubacji, przy użyciu systemu myjki do płytek, umyć płytkę buforem myjącym FACS, stosując dziewięciokrotny cykl mycia. Każde płukanie dodaje i usuwa 55 mikrolitrów buforu płuczącego przez przepływ laminarny, co powoduje wykładnicze rozcieńczenie odczynników w studzienkach.

Aby zabarwić antygeny powierzchniowe, najpierw rozcieńczyć jedną jednostkę objętości przeciwciał anty-CD3, anty-CD4, anty-CD8 i anty-CD69 w 100 objętościach jednostek buforu płuczącego FACS. Następnie ponownie zawieś komórki w 25 mikrolitrach mieszaniny przeciwciał barwiących. Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę, a następnie pozostaw płytkę na lodzie na 30 minut.

Aby naprawić komórki, najpierw umyj płytkę 55 mikrolitrami buforu myjącego FACS, używając dziewięciokrotnego cyklu mycia, jak opisano powyżej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu do utrwalania i przepuszczalności do każdej studzienki. Dobrze wymieszaj i inkubuj talerz na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji przygotuj 1x bufor do trwałej ondulacji/płukania, rozcieńczając 25 mililitrów dostarczonego 10x bulionu w 225 mililitrach ultraczystej wody.

Zalać myjkę do płytek 1x buforem i umyć płytkę 55 mikrolitrami 1x buforu, stosując dziewięciokrotny cykl mycia, jak opisano wcześniej. Wymieszaj 1 mililitr przeciwciała anty-kaspazy-3 z 2 mililitrami 1x trwałej ondulacji i przepłucz bufor. Dodaj 25 mikrolitrów mieszaniny na studzienkę do utrwalonych komórek.

Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę. Pozostaw talerz na lodzie na godzinę. Pod koniec inkubacji powtórzyć etap płukania, dziewięć razy z 1x trwałą ondulacją i buforem do płukania. Następnie dodaj 25 mikrolitrów buforu płuczącego FACS do wszystkich dołków płytki, kilka razy pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać roztwór.

Na koniec przenieś zmieszane próbki do probówek do mikromiareczkowania. Uzupełnij probówki buforem płuczącym FACS do całkowitej objętości 200 mikrolitrów i przystąp do analizy cytometrii przepływowej.