Aktywacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na przeciwciała

Po ekspozycji na patogen makrofagi ulegają aktywacji i uwalniają cytokiny prozapalne i przeciwzapalne, koordynując odpowiedź układu odpornościowego.

Aby zbadać aktywację makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego in vitro, należy przenieść izolowaną zawiesinę komórek szpiku kostnego myszy do kolby hodowlanej. Krótko inkubować.

Komórki mezenchymalne, monocyty i dojrzałe makrofagi przylegają do powierzchni kolby, podczas gdy hematopoetyczne komórki progenitorowe pozostają w zawiesinie.

Zebrać pożywkę zawierającą krwiotwórcze czynniki progenitorowe i odwirować. Przenieść komórki zawieszone w pożywce mleczka stymulującego tworzenie kolonii makrofagów, M-CSF, do kolby hodowlanej.

M-CSF powoduje, że subpopulacja przodków szpiku różnicuje się w makrofagi, które wydają się rozgałęzione i przylegają do kolby.

Wyrzuć nieprzylegające pożywki zawierające komórki. Dodaj pożywkę M-CSF i inkubuj. Gdy makrofagi osiągną w pełni funkcjonalny stan, zbierz je. Wirówka.

Makrofagi płytkowe zawieszone w pożywkach M-CSF do wielodołkowych dołków płytkowych. Po przyleganiu makrofagów do studzienek dodaj ludzkie immunoglobuliny poliklonalne i bakteryjny lipopolisacharyd, LPS, toksynę.

Immunoglobuliny wiążą się ze specyficznymi receptorami FCγ, podczas gdy LPS wiąże się z receptorami Toll-podobnymi na makrofagach. Ta kostymulacja napędza przeciwzapalną aktywację makrofagów poprzez kaskady sygnalizacyjne w dół, powodując uwalnianie wysokich poziomów cytokin przeciwzapalnych i niskich poziomów cytokin prozapalnych.

Zbierz pożywki zawierające cytokiny do dalszej analizy, aby potwierdzić aktywację makrofagów.

Zabezpiecz uśpioną mysz na wznak na piankowej desce z wyciągniętymi kończynami, a następnie wyczyść nogi 70% etanolem. Następnie wykonaj płytkie nacięcie o głębokości około 2 milimetrów, aby usunąć skórę i sierść z powierzchni każdej tylnej nogi. Następnie wypreparuj tkanki, aby uzyskać dostęp do piszczeli i kości udowych.

Aby usunąć piszczele i kości udowe, przetnij kość i mięśnie tuż poniżej stawu biodrowego i powyżej kostek. Następnie usuń jak najwięcej tkanki mięśniowej z kości. Następnie oczyść kości 70% etanolem i pozwól mu odparować przez 1 minutę, a następnie umieść kości na 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką do płukania kości.

Na płytce przytnij 1 milimetr od każdego końca kości udowych, tak aby ich wewnętrzne ubytki były odsłonięte. Upewnij się, że igła o rozmiarze 26 ma dostęp do ubytków. Następnie oddziel kość piszczelową i udową od stawu kolanowego. Następnie włóż igłę przymocowaną do 10-mililitrowej strzykawki do jamy kostnej i zbierz szpik kostny.

Połącz szpik kostny ze wszystkich 4 kości w 50-mililitrowej stożkowej probówce z 5 mililitrami pożywki do płukania kości. Kilkakrotnie odpipetować pożywkę i szpik w górę i w dół lub wirować z małą prędkością, aby delikatnie rozproszyć grudki w zawiesinie. Sznurki szpiku należy rozbić na małe drobinki szpiku o długości mniejszej niż pół milimetra.

Następnie uzupełnij probówkę do 50 mililitrów pożywką do płukania kości i przenieś ją do kolby do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Inkubuj szpik kostny przez godzinę. Podczas inkubacji dojrzałe komórki będą przylegać do kolby, a pożądane krwiotwórcze komórki progenitorowe pozostaną w zawiesinie. Przenieś zawiesinę do 50-mililitrowej stożkowej rurki i odwiruj komórki w granulkę.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 mililitrach pożywki hodowlanej MCSF. Następnie dostosuj gęstość komórek do 500 000 na mililitr i załaduj 30 mililitrów do nowej kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Kontynuuj hodowlę komórek, a w dniach 4, 7 i 10 sprawdź, czy komórki przylegają i są lekko rozgałęzione za pomocą mikroskopu jasnego pola z odwróconym kontrastem fazowym.

Podczas sprawdzania komórek należy wyrzucić pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki. Następnie przemyj przylegające komórki jednorazowo IMDM i dodaj 30 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej MSCF z powrotem do kolby. W dniu 10 zastąp pożywkę 8 mililitrami bezenzymatycznego buforu dysocjacji komórek na bazie EDTA, aby zebrać komórki. Krótko inkubuj komórki, a następnie delikatnie zeskrob je i sprawdź, czy zostały uwolnione za pomocą mikroskopu.

Po uwolnieniu komórek przenieś bufor z komórkami do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie przepłucz kolbę trzykrotnie 5 mililitrami IMDM, aby zebrać więcej komórek. Połącz wszystkie kolekcje, odwiruj je i ponownie zawieś osad w 3 mililitrach MCSF. Teraz policz komórki i dostosuj ich stężenie do 1 miliona na mililitr.

Następnie umieść 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na studzience w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Cała płyta powinna nadawać się do wypełnienia. Hoduj komórki przez około godzinę, aż będą przylegać. Następnie stymuluj je różnymi stężeniami LPS lub immunoglobuliny podawanej dożylnie, lub obu, przygotowanych w IMDM. Wykonaj wszystkie manipulacje w dwóch lub trzech powtórzeniach i upewnij się, że trzymasz nieleczone kontrole, a następnie inkubuj komórki przez 24 godziny i analizuj supernatanty.