JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:05 min. • July 8th, 2025
Makrofagi otrzewnowe, znajdujące się w jamie otrzewnej, pochłaniają patogeny i wydzielają cytokiny prozapalne i przeciwzapalne w celu modulowania odpowiedzi immunologicznej.
Aby zbadać in vivo aktywację makrofagów otrzewnowych, zacznij od powstrzymania myszy, aby zminimalizować jej ruch. Weź mieszaninę lipopolisacharydów - antygenów pochodzących z patogenów i dożylnych immunoglobulin i wstrzyknij je dootrzewnowo.
Po wstrzyknięciu lipopolisacharydy wiążą się z receptorami rozpoznawania wzorców makrofagów, wywołując odpowiedź immunologiczną i uwalniając cytokiny prozapalne, w tym IL-12.
Natomiast immunoglobuliny oddziałują z receptorami Fc makrofagów, obniżając odpowiedź immunologiczną poprzez hamowanie produkcji IL-12 i promowanie uwalniania cytokin przeciwzapalnych, w tym IL-10. Ta kostymulacja przez lipopolisacharydy i immunoglobuliny aktywuje makrofagi otrzewnowe w makrofagi przeciwzapalne.
Zabezpiecz uśpioną mysz i wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż jamy brzusznej. Wycofaj skórę z mięśnia brzucha. Wstrzyknąć bufor do jamy otrzewnej; mieszać w celu usunięcia komórek z jamy otrzewnej.
Pobrać aktywowany płyn otrzewnowy zawierający makrofagi.
Hoduj te aktywowane makrofagi w pożywce zawierającej cząsteczki kostymulujące - immunoglobuliny i lipopolisacharydy, aby umożliwić produkcję cytokin. Zebrać zużytą pożywkę i określić ilościowo poziomy cytokin za pomocą testu immunoenzymatycznego
.Wyższe stężenie IL-10 niż IL-12 potwierdza skuteczną przeciwzapalną aktywację makrofagów otrzewnej.
Przygotuj 1-mililitrową strzykawkę z wymaganą ilością dożylnej immunoglobuliny i LPS i przymocuj igłę o rozmiarze 26. W przypadku formantów należy użyć usługi PBS i LPS.
Chwyć mysz za kark, jednocześnie zabezpieczając jej zad i ogon jedną ręką. Celuj w prawy dolny kwadrant brzucha i włóż igłę pod kątem 30 do 40 stopni skosem do góry i włóż ją na około 1,5 cm. Następnie należy wstrzyknąć bolus. Po godzinie zbierz makrofagi otrzewnej po eutanazji myszy.
W sterylnym kapturze przypnij uśpioną mysz do piankowej deski z rozłożonymi kończynami i wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Następnie wykonaj płytkie 2-milimetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej i ściągnij skórę brzucha. Unikać nakłuwania ściany otrzewnej.
Następnie w pełni załaduj 5-mililitrową strzykawkę sterylnym PBS o pH 7,4 i wstrzyknij mysz za pomocą igły o rozmiarze 25 lub 27 w górę jamy otrzewnej z obu stron w kierunku linii środkowej, ze skosem igły do góry. Po wyciągnięciu igły masuj otrzewną przez 10 sekund, aby usunąć komórki.
Teraz ponownie włóż igłę z powrotem do jamy i zbierz około 3,75 mililitra płynu do płukania. Przenieś płyn płukany do 15-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie. Powtórz wstrzyknięcie, masaż i zbieranie płynu do płukania jeszcze trzy razy, a następnie zbierz wszystkie zebrane wody w tej samej probówce.
Podczas końcowego pobierania może być łatwiej pobrać płyn z płukania z drugiej strony myszy. Następnie odwiruj komórki i zawieś je ponownie w 500 mikrolitrach podłoża galwanicznego. Następnie policz żywotne makrofagi i ponownie zawieś je na poziomie 1 miliona na mililitr. Teraz umieść 100 mikrolitrów zawiesiny w dołkach 96-dołkowej płyty z płaskim dnem. Następnie inkubuj komórki przez godzinę.
Makrofagi otrzewnowej przylegają do płytki. Następnie usuń nieprzylegające komórki i przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 200 mikrolitrami ciepłego IMDM. Po każdym myciu odczekaj 10 sekund i powoli przechylaj płytkę, aby zebrać roztwór do płukania. Po umyciu dodaj z powrotem 100 mikrolitrów podłoża galwanicznego i umieść płytkę w inkubatorze.
W przypadku testu ELISA należy kontynuować inkubację komórek bez stymulacji przez 24 godziny. Następnie zbierz i sklaruj kondycjonowaną pożywkę do analizy cytokin.