JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 8:18 min • July 8th, 2025
Aby zbadać odporność wywołaną szczepionką, należy wykonać zastrzyk wypełniony bezkomórkową szczepionką przeciwko krztuścowi. Szczepionka zawiera białka antygenowe bakterii wywołującej choroby układu oddechowego — Bordetella pertussis — oraz adiuwanty, które przedłużają ekspozycję na antygen w celu uzyskania trwałej odpowiedzi immunologicznej.
Szczepionkę należy wstrzyknąć domięśniowo znieczulonej myszy.
Po wstrzyknięciu rezydentne komórki prezentujące antygen, APC, wychwytują i przetwarzają białka antygenowe w peptydy, prezentując je na swojej powierzchni. Te APC następnie migrują do pobliskich węzłów chłonnych i wchodzą w interakcję z limfocytami T, inicjując ich aktywację i różnicowanie w efektorowe limfocyty T.
Te efektorowe limfocyty T krążą i migrują do różnych narządów, w tym do płuc, gdzie przebywają jako rezydujące limfocyty T pamięci lub limfocyty TRM, co prowadzi do immunizacji.
Po szczepieniu donosowo podawać oporny na antybiotyki szczep żywej Bordetella pertussis. Bakterie te dostają się do tkanki płucnej i aktywują limfocyty TRM. Aktywowane limfocyty TRM wydzielają cytokiny zapalne, które rekrutują komórki odpornościowe do wywołania klirensu bakteryjnego.
Zbierz tkankę płucną myszy i zhomogenizuj ją, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Rozcieńczoną zawiesinę komórkową rozprowadzić na płytce agarowej zawierającej antybiotyk i inkubować ją, aby umożliwić utworzenie kolonii bakteryjnej.
Ekstrakt tkankowy z uodpornionej myszy wykazuje mniej kolonii w porównaniu z ekstraktem z myszy nieuodpornionej, co potwierdza odporność wywołaną szczepionką przeciwko Bordetella pertussis.
W celu uodpornienia należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy w wieku od 6 do 12 tygodni i załadować 1-mililitrową strzykawkę insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 28,5 z 0,1 mililitra interesującej nas szczepionki. Trzymając strzykawkę pod kątem 45 stopni, ze skosem skierowanym do góry, wprowadzić igłę na około 5 milimetrów w naramiennik myszy i wstrzyknąć szczepionkę.
Trzymaj igłę wbitą w mięsień przez 5 do 10 sekund. Następnie należy obrócić strzykawkę o 180 stopni, tak aby skos był skierowany w dół, aby utworzyć uszczelnienie i zapobiec wyciekowi szczepionki przed powolnym wycofywaniem igły z miejsca wstrzyknięcia. Następnie wróć mysz do klatki z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.
Około dwa tygodnie po wzmocnieniu zainfekuj uodpornione myszy. Chwyć znieczuloną mysz za kark grzbietowej klatki piersiowej za łopatkami i szyją i ustaw mysz pionowo, aby uzyskać dostęp do nosa. Używając końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, powoli nałóż od 20 do 25 mikrolitrów interesującego nas inokulum bakteryjnego na każdą warstwę zwierzęcia, trzymając mysz do momentu wdychania całego inokulum. Następnie należy dostarczyć równą objętość sterylnego PBS jednej grupie myszy jako kontrolę ujemną.
W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu umieść zakażoną mysz brzuszną stroną do góry na desce preparacyjnej i zabezpiecz kończyny. Zwilż ciało 70% etanolem i za pomocą kleszczy ściskaj skórę poniżej brzucha na środku miednicy. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj pionowe cięcie aż do żuchwy i wypreparuj skórę ze ściany otrzewnej. Przesuń skórę na boki tuszy, aby stworzyć niezakłócone pole do sterylnego pobierania narządów, i chwyć nienaruszoną otrzewną poniżej klatki piersiowej w wątrobie lub w jej pobliżu. Przetnij otrzewną w kierunku klatki piersiowej, aby odsłonić dolny odcinek przewodu pokarmowego, i przesuń okrężnicę w lewo, aby odsłonić śledzionę.
Za pomocą zakrzywionych kleszczy chwyć śledzionę i wypreparuj tkankę łączną nożyczkami. Następnie umieść śledzionę w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 3 mililitry RPMI i 5% płodowej surowicy bydlęcej na lodzie. Użyj kleszczy, aby ustabilizować klatkę piersiową w wyrostku mieczykowatym i rozciąć przeponę. Płuca powinny opróżnić się i opaść w kierunku kręgosłupa.
Rozetnij klatkę piersiową po bokach, aby usunąć napierśnik, a następnie przetnij tętnice płucne i żyły, aby wyizolować i usunąć górny płat prawego płuca. Umieść płat w 15-mililitrowej stożkowej probówce z 10% neutralnie buforowaną formaliną w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny i odizoluj pozostałe płaty prawego i lewego płuca. Następnie umieść płatki w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 2 mililitry 1% kazeiny w PBS na lodzie.
Użyj 1-mililitrowego PIPETMANA z końcówką, aby zebrać krew wypełniającą jamę klatki piersiowej i przenieś krew do wstępnie oznakowanej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Usuń ślinianki przyuszne, podjęzykowe i podszczękowe oraz węzły chłonne pokrywające tchawicę, a następnie otwórz i usuń błony ochronne otaczające tchawicę. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek ostrożnie oddziel tchawicę od przełyku, a wszelką inną tkankę łączną od górnej części obojczyków do dolnej części żuchwy.
Użyj kleszczy, aby przytrzymać tchawicę i przeciąć tchawicę w górnej części obojczyka. Pociągnij tchawicę w dół, aby zmaksymalizować elastyczność, i przetnij tchawicę na dole żuchwy tuż nad krtanią, izolując około 1 centymetra tkanki. Następnie umieść narząd we wstępnie oznakowanej 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 0,3 mililitra 1% kazeiny w PBS na lodzie.
Teraz obróć mysz, aby uzyskać wyraźny dostęp do nosa, i spryskaj głowę 70% etanolem. Ręcznie chwyć zwierzę bezpośrednio za czaszkę i nożyczkami odetnij miękkie mięso pyska, zaczynając od dołu nosa i przesuwając się w górę. Usuń futro, skórę i wąsy z okolic nosa i włóż końcówki zakrzywionych nożyczek do nozdrza z krzywiznami skierowanymi w dół.
Rozetnij przewód nosowy w kierunku oczu, tworząc formację przypominającą literę V. Następnie użyj cienkich kleszczy, aby zebrać przegrodę nosową i tkankę miękką w formacji, a następnie umieść tkankę we wstępnie oznakowanej 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 0,3 mililitra 1% kazeiny w PBS na lodzie.
Aby przetworzyć tkankę płucną, przenieś całą zawartość probówki z próbką płuc do sterylnego 15-mililitrowego homogenizatora z dounce i użyj tłuczka do homogenizacji tkanki. Oddziel próbkę, aż nie pozostaną żadne duże cząstki tkanki, a następnie zwróć homogenizowaną zawiesinę do oryginalnej 15-mililitrowej probówki. Usunąć 0,3-mililitrową podwielokrotność do posiewu jednostek tworzących kolonie i zebrać resztę homogenatu przez odwirowanie.
Podwielokrotność 0,5 mililitra supernatantu przelać do wstępnie znakowanych probówek mikrowirówek w celu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy ekspresji cytokin metodą ELISA. Następnie seryjnie rozcieńczyć 0,1 mililitra podwielokrotności odłożonej na bok homogenizowanej zawiesiny płuc w 0,9 mililitra sterylnego PBS na rozcieńczenie i użyć sterylnego trójkątnego rozsiewacza do nałożenia 0,1 mililitra każdego empirycznie wybranego rozcieńczenia na wstępnie oznakowanych 10% płytkach Bordet-Gengou plus streptomycyna.