Dynamika organelli w limfocytach B po aktywacji kulkami pokrytymi antygenem

Receptory limfocytów B, BCR, na limfocytach B, wiążą antygeny, powodując aktywację komórek. Prowadzi to do internalizacji antygenu w celu przetworzenia na fragmenty peptydów, które są ładowane na cząsteczki MHC klasy II w celu prezentacji limfocytom T pomocniczym w celu wytworzenia skutecznej odpowiedzi immunologicznej.

Aby zbadać aktywację limfocytów B in vitro za pomocą kulek pokrytych antygenem, najpierw uzyskaj kulki pokryte antygenem. Koraliki te są kowalencyjnie pokryte antygenami, ligandami specyficznymi dla BCR; niereaktywne białko blokuje niezwiązane miejsca kulek, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu limfocytów B.

Dodaj kulki do zawiesiny limfocytów B. Wysiewaj mieszaninę na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną.

Ujemnie naładowane limfocyty B wiążą się z dodatnio naładowanym szkiełkiem nakrywkowym, unieruchamiając komórki. Co więcej, antygeny kulek wiążą się specyficznie z BCR. Interakcja BCR z antygenem aktywuje limfocyty B, tworząc ścisłe połączenie - synapsę immunologiczną.

Interakcja inicjuje wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, co skutkuje reorganizacją cytoszkieletu aktynowego. Powoduje to rozprzestrzenianie się błony komórkowej, a następnie skurcz, podczas którego mikroklaster antygenu BCR koncentruje się w centrum synapsy immunologicznej.

Podczas przebudowy aktyny centrosom - centrum organizujące mikrotubule - przemieszcza się w pobliżu synapsy. Repozycja rekrutuje organelle, takie jak lizosomy i aparat Golgiego w pobliżu synapsy immunologicznej, w celu ekstrakcji i prezentacji antygenów.

Kulki powlekane antygenem są przygotowywane przez inkubację określonych ligandów z kulkami aminowymi uprzednio potraktowanymi aldehydem glutarowym w celu aktywacji grup aminowych. Ponownie zawiesić aktywowane kulki w 100 mikrolitrach PBS i wirować. W międzyczasie przygotuj roztwór antygenu, dodając 100 mikrogramów na ml liganda BCR w 150 mikrolitrach PBS.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów aktywowanych kulek do roztworu antygenu i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pamiętaj, że jako kontroli negatywnej należy również użyć niespokrewnionego liganda. Po inkubacji przemyć kulkę PBS, odessać supernatant i zastąpić PBS. Powtórz trzy razy. Następnie zablokuj wolne grupy aminowe poprzez ponowne zawieszenie kulek w 500 mikrolitrach roztworu BSA. Na koniec ponownie zawieś kulki w 70 mikrolitrach PBS.

Aby obliczyć końcowe stężenie, możesz użyć hemocytometru do policzenia kulek. Do aktywacji limfocytów B należy użyć probówki o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić komórki do stężenia 1,5 miliona na ml w CLICK uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą. Następnie dodaj 150 000 komórek B odpowiadających 100 mikrolitrom mieszaniny komórek i kulek do szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną i inkubuj w temperaturze 37 stopni dla różnych punktów czasowych.