Aktywacja limfocytów B na szkiełku nakrywkowym pokrytym antygenem

Aktywacja limfocytów B polega na rozpoznawaniu antygenów przez receptory limfocytów B, BCR, na ich powierzchni w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.

Aby zbadać aktywację limfocytów B in vitro, należy rozpocząć od szkiełka nakrywkowego zawierającego antygeny i przeciwciała anty-CD45R, unieruchomionego na materiale polimerowym. Ujemnie naładowane antygeny i przeciwciała oddziałują z dodatnio naładowanymi polimerami na szkiełku nakrywkowym poprzez oddziaływania elektrostatyczne.

Pokryte szkiełka nakrywkowe pokryć pożywką zawierającą limfocyty B i rozpocząć inkubację. CD45R - białko transbłonowe komórek B - oddziałuje z unieruchomionymi przeciwciałami, ułatwiając adhezję komórek.

BCR na przylegających komórkach B oddziałują z antygenem, tworząc synapsę immunologiczną - region koordynacyjny dla sygnalizacji komórkowej i internalizacji antygenu. Sprzyja to przebudowie cytoszkieletu i inicjuje rozprzestrzenianie się komórek, co zwiększa powierzchnię komórki w kontakcie z antygenami.

Dalsza przebudowa powoduje ruch antygenów sprzężonych z BCR w kierunku centrum synapsy immunologicznej. To przegrupowanie komórkowe powoduje przemieszczenie centrosomu w pobliżu błony synaptycznej, która prowadzi organelle wewnątrzkomórkowe, w tym lizosomy, w kierunku synapsy.

Fuzja lizosomów z błoną prowadzi do internalizacji kompleksów antygen-BCR. Zinternalizowane antygeny są przetwarzane na fragmenty peptydów, ładowane na główny kompleks zgodności tkankowej klasy II lub cząsteczki MHC, a na koniec prezentowane na aktywowanych limfocytach B.

Przygotować roztwór antygenu, dodając anty-BCR i B220 w PBS do końcowego stężenia odpowiednio 10 mikrogramów na ml i 7,5 mikrogramów na ml. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na pokrywie 24-dołkowej płytki pokrytej folią parafinową i dodaj 40 mikrolitrów roztworu antygenu. Zamknij płytkę, a następnie inkubuj w temperaturze czterech stopni przez noc.

Aby rozpocząć aktywację w szkiełku nakrywkowym, najpierw umyj je PBS i pozostaw do wyschnięcia na kilka minut. Następnie dodaj 150 000 komórek B i inkubuj w temperaturze 37 stopni dla różnych punktów czasowych. W obu przypadkach, przy aktywacji za pomocą kulek lub szkiełek powlekanych antygenem, zalecamy rozpoczęcie od najdłuższego punktu czasowego, a następnie przejście do krótszych.