Wpływ przeciwciała anty C-fms na osteoklastogenezę w komórkach szpiku kostnego myszy in vitro

Osteoklastogeneza to proces, w którym prekursory osteoklastów różnicują się i łączą się, tworząc wielojądrowe osteoklasty.

Aby zbadać wpływ przeciwciała anty-c-fms na osteoklastogenezę in vitro, należy pobrać płytkę hodowlaną zawierającą zawiesinę komórek szpiku kostnego myszy. Dodaj czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów, M-CSF.

W hodowli M-CSF wiąże się ze swoim specyficznym receptorem, c-fms, na komórkach prekursorowych szpiku, aktywując szlaki sygnałowe i powodując różnicowanie do makrofagów szpiku kostnego, BMM, które reprezentują prekursory osteoklastów i przylegają do płytki.

Usuń nieprzylegające komórki. Zbierz BMM i wysiew je w wielodołkowych dołkach płytkowych. Suplement z M-CSF i aktywatorem receptora liganda czynnika jądrowego kappa-Β, RANKL.

Dodaj rosnące stężenia przeciwciał anty-c-fms do studzienek.

W studzience kontrolnej M-CSF wiąże się z receptorami c-fms i aktywuje szlaki sygnałowe, stymulując ekspresję receptora RANK i promując przeżycie i proliferację BMM. RANKL wiąże się z receptorami RANK, wyzwalając kaskadę sygnalizacyjną i powodując różnicowanie BMM i fuzję z osteoklastami.

W studzienkach o wyższych stężeniach przeciwciał wiążą się i skutecznie blokują receptory c-fms oraz zakłócają sygnalizację wymaganą do różnicowania osteoklastów, hamując w ten sposób tworzenie osteoklastów.

Wykonaj barwienie w celu identyfikacji i ilościowego określenia populacji osteoklastów oraz określenia skutecznego stężenia przeciwciał w celu zahamowania osteoklastogenezy w tworzeniu osteoklastów indukowanym przez RANKL.

Wysiewaj 10 milionów komórek na 10 mililitrów w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF do komórek. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 3 dni. Usuń pożywkę po trzech dniach i umyj komórki dwukrotnie, energicznie, 10 mililitrami PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki.

Dodaj 5 mililitrów 0,02% trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej w PBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 5 minut. Dokładnie odpipetuj komórki, aby je odłączyć. Obserwuj kulturę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki zostały oderwane i wydają się zaokrąglone i unoszące się w pożywce.

Po odłączeniu komórek dezaktywuj reakcję, dodając 5 mililitrów alfa-MEM. Zbierz komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki i wiruj przy 300 x g przez 5 minut. Po odrzuceniu supernatantu przemyć 5 mililitrami alpha-MEM i ponownie odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Zawiesić osad w 10 mililitrach alpha-MEM.

Wysiewaj 1 milion komórek na 10 mililitrów w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 3 dni. Po 3 dniach zbierz przyłączone komórki, które reprezentują BMM jako prekursory osteoklastów. Wysiewaj BMM w ilości 50 000 komórek na 200 mikrolitrów alfa-MEM w 96-dołkowej płytce na dołek.

Do każdej studzienki dodaj pożądane bodźce, a następnie dodaj M-CSF, aby uzyskać końcowe stężenie 100 nanogramów na mililitr. Dodaj przeciwciało anty-c-fms do każdej studzienki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 4 dni, zmieniając pożywkę co drugi dzień przez 4 dni, a następnie przystąp do barwienia i oznaczania zgodnie z opisem w manuskrypcie.