JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:50 min • July 8th, 2025
Siarczan dekstranu sodu lub DSS wywołuje zapalenie jelita grubego - chorobę zapalną jelit - w której przerwanie bariery nabłonkowej jelit prowadzi do stanu zapalnego.
Aby ocenić uszkodzenie tkanki, należy pobrać utrwaloną tkankę okrężnicy wyizolowaną z mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS. Zanurz tkankę w podłożu do zatapiania, aby ułatwić cięcie, i szybko zamroź.
Za pomocą kriomikrotomu uzyskaj cienki wycinek tkanki i zbierz go na szkiełku podstawowym.
Zanurz szkiełko w roztworze zawierającym utleniony barwnik hematoksyny związany z zaprawą - kationem metalu - nadając barwnikowi ładunek dodatni. Kompleks barwnikowo-zaprawowy wiąże się z ujemnie naładowanym DNA, barwiąc jądro na czerwono-fioletowo.
Zanurz tkankę w różnicującym roztworze kwasowo-alkoholowym, usuwając niespecyficznie związany barwnik z cytoplazmy i macierzy zewnątrzkomórkowej. Opłucz tkankę w środku niebieszczącym - środowisku alkalicznym - nadając jądrom niebieski kolor, zwiększając kontrast.
Zanurz szkiełko w rosnącym stężeniu alkoholu, aby odwodnić tkankę, zwiększając penetrację przeciwplam.
Zanurz tkankę w przeciwbarwniku - kwaśnym roztworze eozyny - nadając różowy kolor podstawowym białkom cytoplazmatycznym i macierzy zewnątrzkomórkowej. Umyj szkiełko alkoholem, aby usunąć nadmiar eozyny. Zanurz tkankę w ksylenie, aby tkanka była przezroczysta - dla lepszego badania mikroskopowego.
Pod mikroskopem odcinek okrężnicy wykazuje pogłębione uszkodzenie tkanki, co wskazuje na zapalenie jelita grubego wywołane przez DSS.
W celu barwienia izolowanej tkanki okrężnicy hematoksyliną i eozyną, następnego ranka zanurz fragmenty tkanki w 30% sacharozie w PBS przez noc w indywidualnych 15-mililitrowych probówkach w celu krioochrony próbek. Następnego dnia osadź tkanki w optymalnej temperaturze cięcia lub związku OCT i schłodzić tkanki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż OCT stwardnieje.
Umieść bloki OCT w kriostacie i ustaw pokrętło grubości na 12 mikrometrów, a następnie pokrój i zbierz zamrożone kawałki o grubości 12 mikrometrów na szklane szkiełka mikroskopowe. Po pocięciu wszystkich tkanek podgrzej szkiełka w temperaturze 65 stopni Celsjusza na gorącej płycie przez 20 minut i umyj krótko podgrzane sekcje w wodzie destylowanej przed barwieniem roztworem barwiącym hematoksylinę przez 5 minut.
Usuń nadmiar roztworu hematoksyliny z bieżącej wody z kranu na 5 minut i rozdziel skrawki 0,5% kwasem solnym w etanolu przez 30 sekund, a następnie spłucz przez 1 minutę pod bieżącą wodą z kranu. Następnie myj próbki przez 1 minutę w PBS, a następnie kolejne 5-minutowe mycie pod bieżącą wodą z kranu.
Pod koniec prania zanurz tkanki w rosnącej serii etanolu na 10 sekund na zanurzenie, a następnie wykonaj barwienie przeciwstawne w eozynie na 2 minuty. W celu odwodnienia próbek zanurz szkiełka w 95% etanolu i 2 podmianach 100% etanolu na 5 minut na zanurzenie, a następnie wyczyść z dwiema 5-minutowymi zmianami ksylenu. Następnie oceń uszkodzenie tkanek proksymalnej, środkowej i dystalnej okrężnicy każdej grupy eksperymentalnej.