Synteza biofilmu in vitro przez Staphylococcus aureus

Biofilmy bakteryjne to trójwymiarowe struktury składające się ze społeczności bakteryjnych osadzonych w samodzielnie generowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, które unikają odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

W przypadku przygotowania biofilmu Staphylococcus aureus in vitro należy przenieść aktywnie rosnącą zawiesinę Staphylococcus aureus o pożądanej gęstości komórek do studzienek pokrytych poli-L-lizyną na płytce wielodołkowej.

Podczas inkubacji w warunkach statycznych dodatnio naładowana powłoka poli-L-lizynowa ułatwia oddziaływania elektrostatyczne z ujemnie naładowanymi glikopolimerami, takimi jak kwasy tejchojowe, na powierzchni bakterii, sprzyjając przyczepianiu się bakterii.

Dzięki dostępnym źródłom składników odżywczych Staphylococcus aureus dzieli się i gromadzi, tworząc mikrokolonie. Dodatkowo bakterie wydzielają macierz zewnątrzkomórkową składającą się z polisacharydów, białek i zewnątrzkomórkowego DNA, która otacza komórki i wspomaga spójność bakteryjną i adhezję powierzchniową.

Przy ciągłym podziale komórek i wydzielaniu macierzy biofilm dojrzewa do trójwymiarowej struktury z wydajną dystrybucją cząsteczek sygnałowych do komunikacji między komórkami.

Po osiągnięciu progowej gęstości bakteryjnej Staphylococcus aureus wydziela proteazy i nukleazy, degradując macierz biofilmu i uwalniając kilka Staphylococcus aureus do pożywki. Usuń podłoże zawierające swobodnie unoszące się bakterie planktonowe.

Delikatnie dodaj bufor, aby zapobiec przerwaniu biofilmu. Usuń bufor zawierający wszelkie pozostałe nieprzyłączone bakterie.

Wytworzony biofilm jest gotowy do dalszych eksperymentów.

Zacznij od uzyskania izolowanych kolonii Staphylococcus aureus z kriokonserwowanego wywaru przy użyciu techniki płytki smugowej na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak agar sojowy tryptyczny. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 mikrolitrami PLL rozcieńczonymi w sterylnej wodzie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Roztwór PLL należy zasysać w sposób aseptyczny, używając pułapki aspiracyjnej wspomaganej podciśnieniem. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.

Przygotuj posiew na noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w MEM-alfa uzupełnionym 2% glukozą i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin przy 200 obrotach na minutę. Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 mikrolitrów do 5 mililitrów świeżego MEM-alfa uzupełnionego 2% glukozą. Następnie inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obrotach na minutę, aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej. Użyj MEM-alfa, aby znormalizować kulturę środkowologarytmiczną do OD 0,1.

Przenieś 150 mikrolitrów znormalizowanej kultury do każdej studzienki 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 20 godzin. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 mikrolitrami HBSS, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Powtórz co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonowe.