Technika in vitro do stymulacji limfocytów przez bakterie chorobotwórcze

Aby stymulować limfocyty za pośrednictwem Haemophilus influenzae — bakterii chorobotwórczej, należy pobrać zawiesinę izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC, w tym limfocytów i komórek prezentujących antygen lub APC.

Dodać zawiesinę bakteryjną i inkubować w temperaturze fizjologicznej.

Receptory rozpoznające wzorce na APC wiążą się z określonymi składnikami komórek bakteryjnych, wywołując fagocytozę. Fagosom - zawierający zinternalizowane bakterie - łączy się z lizosomem, powodując degradację bakterii i przetwarzanie na fragmenty peptydów.

Główne cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej lub MHC wiążą się z fragmentami peptydu i prezentują je na powierzchni komórki jako antygeny. Limfocyty T wiążą się z prezentowanym antygenem poprzez receptor limfocytów T.

Dodaj przeciwciała kostymulujące, które wiążą się ze specyficznymi receptorami powierzchniowymi na limfocytach T. Synergiczne wiązanie indukuje dalszą sygnalizację, aktywując produkcję cytokin limfocytów T.

Dodaj związek blokujący Golgiego - blokujący transport białek pęcherzykowych z retikulum endoplazmatycznego do Golgiego - aby zahamować wydzielanie cytokin z limfocytów T, ułatwiając akumulację cytokin wewnątrzkomórkowych.

Dodaj utrwalacz, aby zachować morfologię komórkową i detergent, aby przepuszczalnie błonę komórkową. Dodaj koktajl fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał, w tym przeciwciał wiążących się z markerami powierzchniowymi specyficznymi dla limfocytów T - znakującymi powierzchnię komórki - i przeciwciał specyficznych dla cytokin, które wnikają do wnętrza komórki, aby związać cytokiny wewnątrzkomórkowe.

Wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć komórki z podwójną fluorescencją - wskazującą na produkcję cytokin przez stymulowane limfocyty T.

Podzielić próbkę krwi obwodowej na podwielokrotności w celu kontroli i stymulacji antygenu. Dodaj przeciwciała kostymulujące do obu próbek, a następnie dodaj nietypowalny H. influenzae do próbki antygenu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 1 godzinę.

Następnie dodać do próbek środek blokujący Golgiego Brefeldin A i inkubować je przez kolejne pięć godzin. Po lizie erytrocytów, jak wykazano wcześniej, utrwal leukocyty za pomocą 500 mikrolitrów od 1% do 2% paraformaldehydu przez 1 godzinę. Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie przeniknij 1 milion komórek 100 mikrolitrami 0,1% saponiny przez 15 minut.

Następnie inkubuj komórki z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Umyj komórki, a następnie przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego. Określ proporcję komórek reagujących na antygen poprzez bramkowanie odpowiednich populacji limfocytów. Wykonaj barwienie tła na niestymulowanych komórkach dla wszystkich cytokin, które mają być analizowane.