Zabijanie komórek K562 przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wystawione na działanie preparatów wyrobów tytoniowych

Komórki nowotworowe aktywują efektorowe komórki odpornościowe do uwalniania cytokin i granulek cytolitycznych zawierających perforynę i granzymy. Perforyna tworzy pory w błonie komórkowej guza, ułatwiając wnikanie granzymu do komórki i inicjując apoptozę, powodując śmierć komórki.

Aby przeanalizować funkcję cytolityczną ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC, po przygotowaniu wyrobu tytoniowego, TPP, ekspozycji, należy pobrać płytkę wielodołkową o rosnących stężeniach TPP. Studzienka zawierająca podłoże pełni rolę kontrolną.

Dodaj zawieszenie PBMC. Główny środek immunosupresyjny TPP, nikotyna, wiąże się z efektorowymi receptorami acetylocholiny genuetynowej PBMC, zmniejszając produkcję cytokin prozapalnych.

wirówka. Usunąć supernatant zawierający TPP. Ponowne zawieszenie PBMC w nośniku. Dodaj do studzienek znakowane fluorescencyjnie komórki K562, ludzkie komórki białaczkowe o zwiększonej podatności na cytotoksyczność komórek efektorowych PBMC.

Komórki efektorowe traktowane TPP ze stłumioną odpowiedzią immunologiczną wykazują zmniejszoną ekspresję perforyny i uwalnianie cytokin, zmniejszając zdolność cytolityczną PBMC.

wirówka. Ponownie zawiesić komórki w buforze, a następnie zastosować nieprzepuszczalny dla komórek barwnik fluorescencyjny. Barwnik dostaje się do komórek z uszkodzonymi błonami i barwi DNA.

Za pomocą cytometru przepływowego określ proporcję martwych i żywych komórek K562 w studzienkach. Niższy odsetek martwych komórek K562 w studzienkach o wyższych stężeniach TPP niż w grupie kontrolnej wskazuje na tłumienie zabijania komórek K562 przez PBMC traktowane TPP.

Po przygotowaniu płytki PBMC poddanych działaniu wyrobów tytoniowych, jak właśnie pokazano, umyj kulturę komórek K562 zebranych przy 80% konfluencji w 10 mililitrach DPBS. Ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach DPBS i policzyć komórki. Następnie dodaj 1 mililitr świeżo przygotowanego roztworu roboczego CFSE do 1 do 2 razy 10 do siódmych komórek K562 w 1 mililitrze kompletnego podłoża i rozproszyć plamę komórkową przez wirowanie.

Inkubować komórki w temperaturze pokojowej. Po dokładnie 2 minutach dodaj 200 mikrolitrów FBS i ponownie wiruj komórki, inkubując je przez kolejne dwie minuty.

Po drugiej inkubacji umyj komórki w 10 mililitrach kompletnego podłoża. Następnie ponownie zawieś osad w kolejnych 10 mililitrach kompletnego podłoża i policz komórki. Teraz odwiruj PBMC poddane działaniu tytoniu i zdekantuj supernatant. Następnie załóż pokrywę, ponownie zawieś komórki przez wirowanie i umyj je w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża na studzienkę.

Aby rozpocząć test zabijania, dodaj komórki K562 znakowane CFSE do PBMC w stosunku 1 do 15 i inkubuj kokulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Po pięciu godzinach odwirować komórki i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulki przez wirowanie, a następnie umyć komórki 200 mikrolitrami buforu roboczego na studzienkę. Następnie dodaj 95 mikrolitrów buforu do biegania, a następnie 5 mikrolitrów 7-AAD, co daje całkowitą objętość 100 mikrolitrów na studzienkę.

Na koniec inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodać 100 mikrolitrów buforu do każdej studzienki i przenieść całą objętość do odpowiednich odpowiednich probówek FACS w celu określenia procentu komórek 7-AAD i CFSE dodatnich za pomocą analizy cytometrii przepływowej.