Technika in vitro do badania leczenia przeciwdrobnoustrojowego na agregatach bakteryjnych

Aby zbadać wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na agregaty bakteryjne, należy wziąć kulturę Pseudomonas aeruginosa w pożywce wzrostowej, która sprzyja tworzeniu się agregatów — symulując wzrost podczas infekcji.

Zmodyfikowane bakterie wykazują ekspresję białka fluorescencyjnego do wykrywania agregatów pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obraz w trzech wymiarach, aby obliczyć objętość agregatów lub biomasy bakteryjnej i zwizualizować wzrost biomasy w czasie, wskazując na wzrost bakterii.

Dodaj kolistynę - kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy - w subletalnym stężeniu, które zabija wrażliwe bakterie, wybierając te tolerancyjne na antybiotyki.

Kolistyna wiąże się z ujemnie naładowanymi lipopolisacharydami lub LPS na zewnętrznej błonie bakteryjnej, przemieszczając mostki kationowe, które stabilizują monowarstwę LPS - uszkadzając integralność błony.

Kolistyna dostaje się do peryplazmy i wiąże się z LPS na błonie komórkowej, rozrywając błonę i powodując lizę komórek. Jako mechanizm przeciwdziałający, określone mutacje genetyczne w podzbiorze bakterii neutralizują ujemny ładunek LPS. Modyfikacja ta hamuje oddziaływanie elektrostatyczne kationowej kolistyny z mniej anionowym LPS - zapobiegając śmierci komórki.

Obraz do wizualizacji zmniejszającej się biomasy w czasie, wskazujący wpływ środka przeciwdrobnoustrojowego. Dodaj jodek propidyny lub PI - barwnik fluorescencyjny - który dostaje się przez uszkodzoną błonę, aby związać DNA, znakując tylko martwe komórki.

Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub FACS, oddzielając komórki podatne znakowane PI i komórki znakowane fluorescencyjnie tolerancyjne na antybiotyki. Komórki są gotowe do dalszych testów.

Aby zobrazować agregaty Pseudomonas aeruginosa za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, pod koniec inkubacji należy oznaczyć trzy dołki płytki hodowlanej jako powtórzenia antybiotykoterapii w jednym dołku jako "kontrolę bez leczenia" i umieścić płytkę na podgrzewanym stoliku mikroskopu.

Wybierz obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w oleju i otwórz zakładkę Zlokalizuj, aby zidentyfikować agregaty bakteryjne w jasnym polu. Zdefiniuj obszar do obrazowania w każdym dołku i użyj modułu Pozycje, aby zapisać pozycję obszaru. Ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nanometrów, a długość fali emisji na 509 nanometrów.

W module Acquisition (Akwizycja) wybierz opcję Z-Stack (Stos Z), aby uzyskać obrazy, a następnie użyj modułu Uśrednianie linii, aby zredukować fluorescencję tła w kanale GFP w całkowitej objętości obrazów stosu Z. Ustaw opcję Szeregi czasowe, aby uchwycić 60 wycinków w każdym dołku w 15-minutowych odstępach przez 18 godzin, a następnie użyj określonej strategii ostrości, aby zapisać płaszczyznę ogniskową dla każdej pozycji, która będzie ponownie obrazowana w każdym punkcie czasowym w trakcie eksperymentu.

4,5 godziny po skonfigurowaniu eksperymentu obrazowania zobrazuj każdą pozycję, aby określić zagregowaną biomasę w każdym z czterech dołków przed dodaniem antybiotyku. Po sześciu godzinach delikatnie dodaj antybiotyk dwa razy poniżej minimalnego stężenia hamującego do środka każdej studzienki, tuż poniżej granicy faz powietrze-ciecz, i kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć obrazowanie po antybiotykoterapii.

Aby wyizolować żywe komórki, pod koniec 18-godzinnego okresu obrazowania należy oznaczyć bakterie w każdej studzience odpowiednią objętością jodku propidyny, zgodnie z zaleceniami producenta. Pod koniec inkubacji należy za pomocą izolowanego pojemnika przenieść płytkę do cytometru przepływowego i ustawić cytometr tak, aby wykrywał GFP i jodek propidyny za pomocą dyszy o średnicy 70 mikronów. Następnie uruchom 1-mililitrowe podwielokrotności każdego supernatantu hodowli przy najniższym natężeniu przepływu, aby posortować żywotne agregaty Pseudomonas aeruginosa dodatnie i nieżywotne w postaci jodku propidyny.