JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:33 min. • July 8th, 2025
Aby rozpocząć test jednostki tworzącej kolonię lub CFU w celu ilościowego określenia żywych bakterii, należy pobrać wielodołkową płytkę zawierającą hodowane makrofagi w pożywce wzrostowej. Zakażenie makrofagów Listeria monocytogenes, bakterią chorobotwórczyą zdolną do wzrostu wewnątrzkomórkowego.
Podczas infekcji makrofagi pochłaniają bakterie, internalizując je w przedziale związanym z błoną - fagosomie.
Bakterie wydzielają toksynę tworzącą pory i rozrywają błonę fagosomalną. W ten sposób bakterie mogą dostać się do cytozolu i replikować się w makrofagach.
Krótko potraktuj zakażone makrofagi gentamycyną, antybiotykiem, który selektywnie eliminuje niezinternalizowane bakterie, zachowując jednocześnie bakterie wewnątrzkomórkowe.
Odessać leżące nad nim podłoże zawierające antybiotyki. Następnie dodaj sterylną wodę destylowaną na zakażone makrofagi, tworząc hipotoniczne środowisko. Prowadzi to do osmozy, w której cząsteczki wody dostają się do komórek i powodują lizę makrofagów, uwalniając składniki wewnątrzkomórkowe, w tym bakterie.
Rozprowadź lizat komórkowy zawierający bakterie wewnątrzkomórkowe na płytce agaru lizogennego, sprzyjając separacji poszczególnych komórek bakteryjnych i umożliwiając ich niezależny wzrost. Podczas inkubacji żywe bakterie rosną na powierzchni agaru i tworzą odrębne kolonie.
Policz kolonie na płytce i uzyskaj CFU, reprezentujące bakterie wewnątrzkomórkowe, które uniknęły odpowiedzi immunologicznej gospodarza i pomyślnie zreplikowały się w zakażonych makrofagach.
Aby zebrać, lekko przechyl naczynie i ostrożnie użyj pipety, aby usunąć całe podłoże ze studni. Dodaj 0,5 mililitra destylowanej sterylnej wody do studzienki. Po 30 sekundach przenieś powstały lizat wodny do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki i energicznie wiruj przez 10 sekund.
Dodaj 4,5 mikrolitra i 50 mikrolitrów lizatu wodnego do 450 mikrolitrów destylowanej sterylnej wody, aby przygotować 10-krotne i 100-krotne rozcieńczenia. Krótko mówiąc, zwiruj, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Dodać 50 mikrolitrów oryginalnych 10-krotnie rozcieńczonych i 100-krotnie rozcieńczonych próbek na płytkach agarowych bulionu lizogenicznego i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza płytek.
Aby oznaczyć powstający Lm, wyekstrahuj 10 mikrolitrów pożywki nakładającej z naczynia i podziel ją na dwie podwielokrotności o pojemności 5 mikrolitrów w probówkach do mikrowirówek. Dodać 5 mikrolitrów DMEM/FCS do jednej podwielokrotności i dodać 5 mikrolitrów DMEM/FCS zawierających 5 mikrolitrów na mililitr gentamycyny do drugiej podwielokrotności jako kontroli.
Odczekaj 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 90 mikrolitrów destylowanej sterylnej wody do każdej porcji i energicznie wiruj probówkę przez 10 sekund. Następnie dodaj 50 mikrolitrów próbki na płytki agarowe LB i rozprowadź za pomocą rozsiewacza płytek. Przechowuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni przed zliczeniem kolonii Lm.