JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:21 min • July 8th, 2025
Weź płytkę wielodołkową zawierającą kulturę makrofagów. Zakażenie bakterią Listeria monocytogenes wykazującą ekspresję białka fluorescencyjnego, Lm.
Białka na Lm wiążą się ze specyficznymi receptorami makrofagów, internalizując bakterie w fagosomie. Dodatkowo Lm wydziela toksyny tworzące pory, które zaburzają błonę fagosomu, uwalniając bakterie do cytozolu, gdzie replikują się i zostają otoczone przez włókna aktyny gospodarza.
Indukujące składanie aktyny białka ActA na Lm indukują ciągłą polimeryzację aktyny na tylnym końcu bakterii. Wygenerowany warkocz komety aktynowej napędza Lm przez cytozol i przenika do błony komórkowej makrofagów, uwalniając spolimeryzowany Lm otoczony aktyną do pożywki.
Po inkubacji zebrać i utrwalić zewnątrzkomórkowe, związane aktyną, zawierające Lm pożywki z zestawu studzienek. Napraw Lm za pomocą paraformaldehydu. Dodaj wodę destylowaną, rozrywając makrofagi i uwalniając wewnątrzkomórkowy Lm. Zebrać wewnątrzkomórkowy Lm i utrwalić próbkę za pomocą paraformaldehydu.
W innych studzienkach zastąp pożywkę nieprzepuszczalną dla komórek pożywką zawierającą gentamycynę, aby wyeliminować zewnątrzkomórkowy Lm. Zastąp nową pożywką i inkubuj przez żądany okres.
Po inkubacji zebrać zewnątrzkomórkowe podłoże zawierające Lm i utrwalić próbkę paraformaldehydem. Użyj wody destylowanej, aby uzyskać lizat zawierający wewnątrzkomórkowy Lm i utrwalić próbkę paraformaldehydem. Do próbek dodać znakowaną fluorescencyjnie falloidynę, która selektywnie wiąże się ze spolimeryzowaną aktyną.
Za pomocą cytometru przepływowego wizualizuj sygnały fluorescencyjne z Lm i falloidyny wiążącej aktynę w próbkach. Określ ilościowo zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy Lm związany z aktyną pochodzący z zakażonych makrofagów.
Za pomocą automatycznego licznika komórek dostosuj przygotowane ogniwa RAW 264.7 do stężenia 1 x 106 komórek na mililitr. Dodaj 1 mililitr próbki do studzienek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Zainfekować komórki przygotowanym inokulum Lm odpowiadającym wielokrotności infekcji 50.
Po 1,5 godziny od zakażenia, w 1,5-milimetrowej probówce mikrowirówkowej wypełnionej 500 mikrolitrami 4% PFA, zbierz pożywkę z pierwszego zestawu studzienek i umieść probówkę na lodzie. Aby zebrać wewnątrzkomórkowy Lm, dodaj 1 mililitr destylowanej sterylnej wody do każdej studzienki. Po 60 sekundach przenieś powstały lizat wodny do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej z 500 mikrolitrami 4% PFA. Energicznie obracaj probówkę przez 10 sekund i umieść ją na lodzie.
W przypadku pozostałych studzienek usuń pożywkę i zastąp ją 1 mililitrem DMEM/FCS 5 mikrogramami na mililitr gentamycyny, aby zabić zewnątrzkomórkową Lm. Niezwłocznie zwróć naczynie do inkubatora.
Po 30 minutach usuń pożywkę i zastąp ją DMEM/FCS bez gentamycyny. Po kolejnych dwóch i czterech godzinach zbierz pożywkę w lizatach dla drugiego i trzeciego punktu czasowego do probówek i umieść je na lodzie do schłodzenia. Odwirować probówki pod ciśnieniem 10 000 razy g przez 7 minut.
Za pomocą pipety usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj koktajl barwiący zawierający 50 mikrolitrów 4% PFA i 15 mikrolitrów falloidyny do probówki i wymieszaj, aby ponownie zawiesić każdą granulkę. Inkubuj probówki w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 20 minut.
Po inkubacji dodaj 1 mililitr buforu FACS do każdej probówki i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Wiruj probówki w wirówce 10 000 razy g przez 7 minut. Usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu.
Do natychmiastowego użycia zawiesić każdą osadkę w 400 mikrolitrach buforu FACS. W przypadku przechowywania do późniejszej analizy dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS i 200 mikrolitrów 4% PFA do probówki i wymieszaj do zawieszenia.