Wykrywanie aktywacji inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Aby wykryć aktywację inflamasomu receptora podobnego do NOD P3 lub NLRP3, weź płytkę wielodołkową zawierającą aktywowane makrofagi eksprymujące białka NLRP3.

Potraktuj komórki pożywką zawierającą jonofory i glicynę. Jonowory indukują wypływ jonów potasu, aktywując i oligomeryzując białka NLRP3. Oligomeryzowany NLRP3 rekrutuje białka adaptorowe, ułatwiając wiązanie pro-kaspazy-1, tworząc kompleks inflamasomu NLRP3.

Na inflamasomie, bliskość wyzwala auto-rozszczepienie pro-kaspazy-1, uwalniając aktywne kaspazy, inicjując piroptozę i kondensację jądrową. Dodatkowo glicyna stabilizuje strukturę komórkową, zapobiegając jej lizie.

Traktuj makrofagi fluorescencyjnymi sondami reporterowymi zawierającymi grupę wiążącą kaspazę-1 i fluorofor połączony sekwencją aminokwasów. Aktywowana kaspaza-1 rozpoznaje sekwencję aminokwasową sondy i wiąże się z jej grupą wiążącą kaspazę, umożliwiając jej wizualizację.

Napraw komórki i pokryj je barwnikiem fluorescencyjnym, aby zabarwić jądra. Obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Policz makrofagi z niebieskimi skondensowanymi jądrami i zielonymi ogniskami fluorescencyjnymi aktywowanej kaspazy-1, co sugeruje aktywację inflamasomu NLRP3.

Zacznij od zastąpienia pożywki z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego zagruntowanych LPS wysianych na szklanych szkiełkach nakrywkowych 290 mikrolitrami pożywki DMEM-5 uzupełnionej 5-mikromolową nigerycyną i 5-milimolową glicyną na studzienkę. Włożyć 24-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, dodając 10 mikrolitrów 30X FAM-YVAD-FMK po pierwszych 15 minutach.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki 1 mililitrem zimnego PBS na studzienkę trzy razy przez 5 minut na mycie i utrwalić komórki 250 mikrolitrami 2% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem, znakując komórki odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym w ciągu ostatnich pięciu minut.

Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie zimnym PBS, jak właśnie pokazano, i załaduj każde szkiełko 7 mikrolitrami podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku podstawowym i pozwól medium montażowemu stwardnieć przez noc, zanim uszczelnisz szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.

Aby zobrazować komórki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, umieść nieleczone szkiełko kontrolne na stoliku mikroskopu i ręcznie ustaw ostrość na komórkach. Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu, dostosuj przesunięcie, aż w nieleczonych komórkach nie będzie można zaobserwować dodatniej pozycji sondy.

Następnie, używając próbki potraktowanej nigerycyną, zlokalizuj pole zawierające komórki, które są zarówno dodatnie, jak i ujemne dla barwienia sondy, i dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału sondy do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego. Następnie dostosuj wzmocnienie, aż ogniska będą widoczne w komórkach ze skondensowanymi jądrami i uzyskaj obrazy pięciu losowo wybranych pól na szkiełko przy 100-krotnym powiększeniu całkowitym.