JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:44 min. • July 8th, 2025
Aby wykryć aktywację inflamasomu receptora podobnego do NOD P3 lub NLRP3, weź płytkę wielodołkową zawierającą aktywowane makrofagi eksprymujące białka NLRP3.
Potraktuj komórki pożywką zawierającą jonofory i glicynę. Jonowory indukują wypływ jonów potasu, aktywując i oligomeryzując białka NLRP3. Oligomeryzowany NLRP3 rekrutuje białka adaptorowe, ułatwiając wiązanie pro-kaspazy-1, tworząc kompleks inflamasomu NLRP3.
Na inflamasomie, bliskość wyzwala auto-rozszczepienie pro-kaspazy-1, uwalniając aktywne kaspazy, inicjując piroptozę i kondensację jądrową. Dodatkowo glicyna stabilizuje strukturę komórkową, zapobiegając jej lizie.
Traktuj makrofagi fluorescencyjnymi sondami reporterowymi zawierającymi grupę wiążącą kaspazę-1 i fluorofor połączony sekwencją aminokwasów. Aktywowana kaspaza-1 rozpoznaje sekwencję aminokwasową sondy i wiąże się z jej grupą wiążącą kaspazę, umożliwiając jej wizualizację.
Napraw komórki i pokryj je barwnikiem fluorescencyjnym, aby zabarwić jądra. Obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Policz makrofagi z niebieskimi skondensowanymi jądrami i zielonymi ogniskami fluorescencyjnymi aktywowanej kaspazy-1, co sugeruje aktywację inflamasomu NLRP3.
Zacznij od zastąpienia pożywki z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego zagruntowanych LPS wysianych na szklanych szkiełkach nakrywkowych 290 mikrolitrami pożywki DMEM-5 uzupełnionej 5-mikromolową nigerycyną i 5-milimolową glicyną na studzienkę. Włożyć 24-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, dodając 10 mikrolitrów 30X FAM-YVAD-FMK po pierwszych 15 minutach.
Pod koniec inkubacji przemyć komórki 1 mililitrem zimnego PBS na studzienkę trzy razy przez 5 minut na mycie i utrwalić komórki 250 mikrolitrami 2% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem, znakując komórki odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym w ciągu ostatnich pięciu minut.
Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie zimnym PBS, jak właśnie pokazano, i załaduj każde szkiełko 7 mikrolitrami podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku podstawowym i pozwól medium montażowemu stwardnieć przez noc, zanim uszczelnisz szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
Aby zobrazować komórki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, umieść nieleczone szkiełko kontrolne na stoliku mikroskopu i ręcznie ustaw ostrość na komórkach. Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu, dostosuj przesunięcie, aż w nieleczonych komórkach nie będzie można zaobserwować dodatniej pozycji sondy.
Następnie, używając próbki potraktowanej nigerycyną, zlokalizuj pole zawierające komórki, które są zarówno dodatnie, jak i ujemne dla barwienia sondy, i dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału sondy do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego. Następnie dostosuj wzmocnienie, aż ogniska będą widoczne w komórkach ze skondensowanymi jądrami i uzyskaj obrazy pięciu losowo wybranych pól na szkiełko przy 100-krotnym powiększeniu całkowitym.