Technika in vitro do badania tworzenia kompleksów inflamasomów w makrofagach

0 wyświetleń3:06 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od płytki zawierającej kulturę pierwotnych makrofagów.

Wprowadź bakteryjny lipopolisacharyd, LPS, który wiąże się z receptorami toll-podobnymi na makrofagach, wywołując regulację w górę białka z rodziny NLR zawierającego domenę piryny 3 lub NLRP3.

Dodaj jonofor, który pośredniczy w wypływie jonów potasu. Obniżony potas cytozolowy aktywuje NLRP3. Aktywowany NLRP3 oligomeryzuje i indukuje rekrutację białka adaptorowego, które z kolei rekrutuje pro-kaspazę-1, tworząc inflamasom.

Autoproteoliza przekształca pro-kaspazę-1 w aktywną kaspazę-1, która pośredniczy w zapalnej śmierci komórek lub piroptozie. Uszkodzenie DNA podczas piroptozy prowadzi do kondensacji jądrowej.

Napraw komórki i potraktuj detergentem, aby je przepuszczalności.

Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe wiążące się z białkiem adaptorowym związanym z inflamasomem oraz znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym, znakując inflamasom.

Wprowadź fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym, aby oznaczyć jądro. Pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki wykazują skondensowane jądra - wskazujące na piroptozę - i ogniska białek adaptorowych - wskazujące na tworzenie się inflamasomów.

W celu analizy immunofluorochemicznej komórek traktowanych nigerycyną, umyj komórki znakowane sondą i inkubuj komórki w 250 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego na studzienkę przez 30 minut na lodzie, chroniony przed światłem.

Przemyj makrofagi jeszcze trzy razy świeżym buforem do płukania i oznacz komórki 250 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białemu podobnemu do plamki związanego z apoptozą, zawierającemu C-końcową domenę rekrutacyjną kaspazy lub ASC, na studzienkę przez jedną godzinę na lodzie.

Umyć komórki pod koniec inkubacji i oznaczyć próbki 250 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym przez kolejną godzinę na lodzie, dodając 4 mikrolitry odpowiedniego fluorescencyjnego barwnika do barwienia jądrowego w ciągu ostatnich 5 minut.

Po 3-krotnym umyciu komórek w buforze do płukania na zimno, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z 7 mikrolitrami podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu, jak pokazano, i zobrazuj makrofagi za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej.

08:47

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:41

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:23

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

05:19

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

03:44

Wykrywanie aktywacji inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:01

Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:04

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

12:47

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

07:54

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:07

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 1 sierpnia 2026