Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia śmierci makrofagów po ekspozycji na nigerycynę

Weź płytkę testową zawierającą makrofagi zagruntowane lipopolisacharydem.

Pobudzanie zwiększa ekspresję nieaktywnych prekursorów cytokin prozapalnych i białek NLRP3.

Dodaj nigerycynę, jonofor potasu, promujący wypływ jonów. To zaburza wewnątrzkomórkowy poziom potasu, wyzwalając białka NLRP3, tworząc duży kompleks.

Oligomeryzowany NLRP3 rekrutuje białka adaptorowe, ASC, powodując ich polimeryzację. Włókna ASC rekrutują pro-kaspazę-1, tworząc NLRP3-inflamasom, kompleks wielobiałkowy.

Pro-kaspaza-1 ulega autoaktywacji indukowanej bliskością, generując kaspazę-1. Kaspaza-1 rozszczepia cytokinę prozapalną i białko gasderminy-D, tworząc pory błony komórkowej.

Powoduje to wydzielanie cytokin i zapalną zaprogramowaną śmierć komórki, piroptozę, uwalnianie treści wewnątrzkomórkowej, w tym dehydrogenazy mleczanowej lub LDH. Zebrać supernatant zawierający LDH.

Dodaj mieszaninę substratów — mleczan, fiolet jodonitrotetrazolowy lub barwnik INT, NAD+ i diaforazę. LDH utlenia mleczan do pirogronianu, jednocześnie redukując NAD+. Diaphoza katalizuje redukcję INT, tworząc formazan o czerwonym zabarwieniu.

Intensywność koloru odpowiada uwalnianiu LDH, przy czym podwyższone poziomy wskazują na zwiększone uszkodzenia i śmierć komórek związane z piroptozą.

Aby wykonać test uwalniania LDH, dodaj 50 mikrolitrów pożywki DMEM-5 uzupełnionej 10 mikromolową nigerycyną do każdej studzienki eksperymentalnej i 50 mikrolitrów DMEM-5 do spontanicznych i 100% studzienek kontrolnych lizy przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 30 minutach dodaj 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu do lizy do 100% studzienek kontrolnych lizy i dodaj 10 mikrolitrów pożywki do pozostałych studzienek. Pod koniec inkubacji odwirować płytkę i przenieść 50 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki na przezroczystą płytkę o płaskim dnie.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów świeżo rozmrożonego i przygotowanego substratu do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w ciemności, sprawdzając płytkę po 15 minutach, aby potwierdzić, że sygnał nie przekroczy granicy wykrywalności czytnika płytek. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i zmierzyć OD₄₉₀ na odpowiednim czytniku płytek, aby umożliwić obliczenie procentowej lizy komórek na studzienkę.