Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej znakowane fluorescencyjnie neutrofile i potraktować je surowicą pacjenta zawierającą przeciwciała cytoplazmatyczne przeciwko neutrofilom.

Przeciwciała te oddziałują z receptorami Fc neutrofili, aktywując szlak sygnałowy, wytwarzając reaktywne formy tlenu lub ROM i aktywując deiminazę peptydyloargininy.

ROS powoduje degranulację neutrofili, uwalniając enzymy – elastazę i mieloperoksydazę do cytoplazmy. Enzymy te i aktywowane deiminazy peptydyloargininowe przemieszczają się do jądra.

Elastaza rozszczepia histon-H1, a mieloperoksydaza modyfikuje histony, inicjując dekondensację chromatyny. Aktywowana deiminaza peptydyloargininy indukuje cytrulinację histonów, przekształcając reszty argininy w cytrulinę i przyczyniając się do dalszej dekondensacji.

Dekondensowana chromatyna miesza się z białkami wewnątrzkomórkowymi, w tym białkami przeciwdrobnoustrojowymi i cytoplazmatycznymi. Później błona neutrofili rozpada się, uwalniając zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z białkami cytoplazmatycznymi do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, tworząc zewnątrzkomórkową pułapkę neutrofili, NET.

Dodaj nieprzepuszczalny dla komórek barwnik DNA, wiążący się wyłącznie z zewnątrzkomórkowym DNA w NET. Pod mikroskopem fluorescencyjnym neutrofile wydają się czerwone z zielonymi strukturami przypominającymi sieć zewnątrzkomórkową, co potwierdza powstanie NET.

Wykonaj zawiesinę komórek o gęstości 420 000 komórek na mililitr w pożywce RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 2% FCS. Dodaj 37 500 neutrofili w 90 mikrolitrach do każdej studzienki czarnej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów wybranego bodźca, w trzech egzemplarzach, aby osiągnąć stężenie 10% w każdym dołku. Kontrolę ujemną należy zawsze dołączyć w trzech egzemplarzach. Inkubuj w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas, od 30 minut do 2, 4 lub 6 godzin. Następnie przygotuj objętość nieprzepuszczalnego barwnika DNA potrzebną do dodania 25 mikrolitrów 5-mikromolowego nieprzepuszczalnego barwnika DNA, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mikromola w każdym dołku.

Na 15 minut przed końcem czasu inkubacji dodać 25 mikrolitrów 5-mikromolowego nieprzepuszczalnego barwnika DNA do każdej studzienki. Kontynuuj inkubację przez ostatnie 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Następnie bardzo ostrożnie usunąć supernatant i przechowywać w razie potrzeby. Dodaj 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu. Trzymaj płytkę w ciemności i natychmiast przejdź do następnej sekcji.

Po skonfigurowaniu ustawień wybierz opcję Z Series (Seria Z). Wybierz 10 jako liczbę kroków. Wybierz 3 mikrometry jako rozmiar kroku. Załaduj płytkę do immunofluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego.

Kliknij zakładkę Uruchom. Wypełnij nazwę i opis tablicy, a następnie wybierz miejsce przechowywania. Wybierz studnie, które chcesz zdobyć. Wybierz czas ekspozycji dla Texas Red i FitC, a następnie kliknij Zdobądź płytkę i rozpocznij akwizycję, która zajmie około 1 godziny na płytkę.

Następnie wybierz opcję Makro analizy. Następnie wybierz W1 i wybierz wartość progową. Następnie wybierz żądaną wartość piksela, a na koniec, w drugim oknie ImageJ, wybierz W2 i wybierz wartość progową z żądaną wartością piksela. Wybierz miejsce docelowe dla pliku arkusza kalkulacyjnego. Uruchom analizę, a następnie zapisz plik dziennika.